A haptoglobin fenotípus kapcsolata az érfunkcióval és az E-vitamin-pótlásra adott válaszával 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegeknél: Az EVAS-vizsgálat (EVAS)

1.0 Háttér és klinikai jelentősége 1.1 Bevezetés A 2-es típusú diabetes mellitus (DM2) előfordulása világszerte és Szingapúrban is gyorsan növekszik. A DM2-ben szenvedő betegek fokozott morbiditásának és mortalitásának fő oka a mikrovaszkuláris és makrovaszkuláris szövődmények kialakulása. Bár a szigorú glikémiás kontroll bizonyítottan csökkenti a mikrovaszkuláris szövődményeket, a makrovaszkuláris szövődmények tekintetében még mindig hiányoznak a bizonyítékok. Ezeknél a betegeknél a felgyorsult atherosclerosis a megnövekedett mortalitás és morbiditás vezető oka. Rendkívül fontos, hogy a hagyományos kezelés mellett új célokat is felmérjünk az atherosclerosis szabályozására DM2-ben szenvedő betegeknél. Kielégítetlen igény mutatkozik olyan új célpontok vagy markerek megtalálására, amelyek előrejelzik a diabetes mellitusban szenvedő betegek fokozott kockázatát, és meg kell fontolnunk az alternatív kezelések lehetőségét a hagyományos célok mellett, hogy csökkentsük a kockázatot ezekben a magas kockázatú betegekben.

A DM2-ben szenvedő betegek nem csak az érelmeszesedés kockázatának vannak kitéve, hanem nagyobb mértékben viselik a betegség terhét is. Az endothel diszfunkciót az ereket érő kóros sértés fémjelének tekintik. A hiperglikémia hatással van a reaktív oxigénfajták (ROS) képződésével kapcsolatos mitokondriális, enzimatikus és nem enzimatikus útvonalakra, ami a nitrogén-monoxid biológiai hozzáférhetőségének csökkenéséhez és az endothel diszfunkciójához vezet, amit általában az endotéliumfüggő értágulat csökkenése és az endothel eredetű szabályozó fehérjék plazmaszintjének emelkedése mutat. Ezen túlmenően a DM2-es betegek antioxidáns védekezőképessége az antioxidáns enzimek és az alfa-tokoferol (E-vitamin) alacsony szintje miatt sérülhet, ami akadályozhatja az oxidatív stressz növekedésének megfelelő kompenzálását. Az oxidatív hipotézisben az oxidatív stressz másik szerepe is kimutatható az ateroszklerózis kialakulásában. Ebben a modellben az oxidatív módosítás legszembetűnőbb célpontja az LDL molekula. Az oxidált LDL-t az LDL-receptor nem ismeri fel, de a CD36 scavenger receptor útvonala könnyen felveszi a makrofágokban, ami jelentős koleszteril-észter-felhalmozódáshoz és habsejtek képződéséhez vezet. Az oxidált LDL proinflammatorikus, gátolja az endothel NO-szintetázt, elősegíti az érszűkületet és a monocita adhéziót, valamint elősegíti a vérlemezke-aggregációt és a trombózist.

Hp fenotípus és oxidatív szövetkárosodás

A haptoglobin (Hp) fehérje antioxidáns, mivel képes semlegesíteni a hemoglobin (Hb) oxidatív aktivitását. Emberben a Hp-t három szerkezetileg eltérő fenotípusú (Hp1-1, Hp 2-1 és Hp 2-2) genetikai polimorfizmus jellemzi, amelyek a haptoglobin gén két különböző alléljának (Hp 1 és Hp 2) expressziójából erednek. 16q22 kromoszóma. A Hp2 allél fehérjeterméke gyengébb antioxidáns, mint a Hp1 allél terméke. A Hp 1-1 egy kis molekula (86 kDa), jól meghatározott szerkezetű, míg a Hp 2-1 heteropolimerek (86-300 kDA), a Hp 2-2 pedig nagy makromolekuláris komplexeket (170-1000 kDa) képez.

A Hp feladata a vörösvértestekből felszabaduló szabad Hb megkötése, amely a vörösvértestek természetes cseréje során kerül a vérbe. A szabad Hb jelentős oxidatív szövetkárosodást képes okozni a hem vasa következtében. Amikor azonban a Hb a keringésbe kerül, azonnal rendkívül nagy affinitással kötődik a Hp-hez, és Hp-Hb komplexet képez. Ez a kötődés gátolja a Hb oxidatív potenciálját azáltal, hogy megakadályozza a hem vas felszabadulását a Hb-ből. A Hp általában több mint 400-szoros moláris feleslegben található a vérben a szabad Hb-hez képest, ezért a Hp képes megkötni a normál vörösvérsejt-forgalom során felszabaduló összes Hb-t. Amint a Hb a Hp-hez kötődik, gyorsan kiürül a véráramból a monocitákon/makrofágokon expresszálódó CD163 scavenger receptoron keresztül, azonban a Hp-Hb komplexek képződése és kiürülése károsodik a Hp 2-2 fenotípusokban.

A Hb-ből származó vas számos oxidatív reakciót képes katalizálni, amelyeket a Hp gátolhat.

1. A vastartalmú hem vas (Fe2+) reakcióba léphet a hidrogén-peroxiddal, így vas(III) Hb-t (Fe3+) és nagy reakcióképességű hidroxilgyököket eredményez. A többszörösen telítetlen zsírsavak hidrogénatomjának elvonásával a hidroxilgyökök elindíthatják a lipidperoxidáció folyamatát.
2. A vas-Hb (Fe2+) hidrogén-peroxiddal is reagálva ferril-Hb-t (Fe4+) hoz létre, egy nagyon instabil molekulát, amely könnyen reagál egy második hidrogén-peroxid-molekulával vas(III)-Hb-t (Fe3+) és szuperoxid-aniont eredményezve. A szuperoxid-anion károsító hatása kettős: a Hb-ben található vas (Fe3+) redukciója vasvassá (Fe2+), amely lehetővé teszi további hidroxilgyök képződését az 1. reakcióban leírtak szerint, valamint a szuperoxid-anion dismutációja hidrogén-peroxid keletkezéséhez. , ismét népszerűsítve a ROS gyártását.

3. A (Fe3+-t tartalmazó) vas-Hb, más néven methemoglobin, spontán átadhatja hem részét, aminek eredményeként a hem különböző lipofil környezetekbe, például LDL-be vagy sejtmembránokba kerül. Miután beépült az új lipidkörnyezetbe, a hem vas reakcióba léphet a fent leírt hidrogén-peroxiddal vagy a szomszédos lipid-peroxidokkal, szabadgyök-kaszkádot generálva, és kiterjedt lipidoxidációhoz vezethet.

   A Hp-Hb komplex részeként a Hp stabilizálja a hemet a Hb hem zsebében, és megakadályozza, hogy a Hb oxidatív sérülést okozzon. Az azonban, hogy a Hp milyen mértékben semlegesíti a hem vas redox aktivitását, különbözik a Hp típusok között. Ezt számos rendszerben kimutatták mind in vitro, mind in vivo. Például a linolénsavval végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a Hp 1-1 megakadályozta az oxidációt (diénképződést), amelyet a 232 nm-en mért abszorbancia nagyobb mértékű növekedésével mértek, mint a Hp 2-2. Egy másik tanulmány az LDL oxidációját vizsgálta a Hb-ről az LDL-re történő hem transzfer miatt. A hem transzfert a danzilált LDL által kibocsátott fluoreszcencia jel kioltásával mértük. Azt találták, hogy a Hp 1-1 jobban megakadályozta a hem transzfert a Hb-ből, mint a Hp 2-2.

   Hp fenotípusok és kardiovaszkuláris kockázati tanulmányok kimutatták, hogy a Hp 2-2 Hb komplexek szintén kevésbé hatékonyan tisztulnak ki, mint a nem Hp 2-2 Hb komplexek. A DM2-es betegeknél ez a jelenség a CD163 downregulációja miatt hangsúlyosabb, különösen a Hp 2-2 egyénekben. A gyulladásgátló makrofágok CD163/pAkt/IL-10 tengelyen keresztüli jelátvitelének károsodása szintén megfigyelhető Hp 2-2 betegekben.

   A Hp-Hb hiányos clearance a Hp 2-2 DM2 egyedekben a Hp-Hb fokozott kötődését eredményezi a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL-C) Apo A1-hez, ezáltal a prooxidatív hem részt a HDL-hez köti. Ez hiányossá teszi azt a képességét, hogy megfordítsa a koleszterint a makrofágokból.

   A Hp 2-2 fehérje kevésbé hatékonyan gátolja a hem transzfert a Hb-ből, mint a Hp 1-1. Ezenkívül a hem transzfer növekedése, amikor a Hb glikozilált, mechanikus magyarázatot adhat a Hp 2-2 DM2-ben megfigyelhető kardiovaszkuláris betegségek növekedésére.

   Ezért a Hp 2-2 fenotípus csökkent Hb-kötő képességgel, a Hp 2-2 Hb komplexek csökkent clearance-ével, a gyulladáscsökkentő jelátviteli útvonal károsodásával, az LDL fokozott oxidációjával jár, ami a HDL-koleszterint hatástalanná és kevésbé hatékonyan gátolja a hem transzfert. Hb-ről Hp 1-1-re, mindez magasabb szív- és érrendszeri kockázathoz vezet. Azoknál a cukorbetegeknél, ahol ezen útvonalak némelyike ​​is érintett, a hiperglikémia és a haptoglobin fenotípus szinergikus hatása fokozódik, ami nagyobb kockázatot jelent.

   Más populációkban végzett longitudinális vizsgálatok azt mutatták, hogy a Hp 2-2 genotípus a DM-ben szenvedő egyénekben 2-5-szörösére megnövekedett CVD kockázatával jár. Konkrétan az erős szívvel végzett vizsgálatban a Hp 2-2 fenotípusú DM-ben a CVD esélye 2-5-ször nagyobb volt, mint a Hp 2-1 fenotípusú DM-ben (p=0,002). A müncheni stent vizsgálatban 935 kezelt diabéteszes egyénből álló sorozatot követtek nyomon a stentelés után egy évig a jelentős nemkívánatos szívesemények miatt. Ebben a vizsgálatban a haptoglobin 2-2 fenotípust a jelentősebb nemkívánatos kardiális események független előrejelzőjének tekintették. Ezen túlmenően azt tapasztalták, hogy az E-vitamin jelentős szív- és érrendszeri előnyökkel jár a Hp 2-2 DM-es betegek számára egy populációban (Izrael-ICARE TANULMÁNY), valamint a WHS (Women Health Study) és a HOPE tanulmány post-hoc elemzése annak megállapítására, hogy a vitamin Az E-kiegészítés a haptoglobin 2-2 fenotípus által befolyásolt mortalitású betegek alcsoportjában nem szignifikáns csökkenést mutatott a teljes mortalitásban. Ezt nem alkalmazták széles körben, mivel nagyobb kísérletekre és több populációra van szükség az összefüggés és az előnyök alátámasztásához.

   Hp fenotípus és etnikai hovatartozás

   Egy Szingapúrban végzett helyi tanulmányban azt találták, hogy a Hp gének gyakorisága a különböző etnikumokban a következőképpen változik: kínai Hp1:0,330;Hp2:0,670;Hp0: 0,029; malájok:Hp1:0,298;Hp2:0,702 ;Hp0:0,004; Indiánok Hp1: 0,167; Hp2: 0,833; Hp0: 0,009. A Hp gyakoriságok eloszlása ​​a mi populációnkban a Hardy-Weinberg egyensúlyban van, így a Hp 2-2 várható prevalenciája 30-40% körüli. A Hp fenotípusokat a TaqMan analízissel határozzák meg a TTSH Kutatólaboratóriumban.

   1.2 Haptoglobin genotípusok és endoteliális funkció

   Az endoteliális diszfunkció egyre nagyobb figyelmet kapott, mint a DM-ben előforduló vaszkuláris betegségek patogenezisének lehetséges hozzájárulója. A DM2-ben az összehúzó és relaxáló faktorok endotélium általi felszabadulásának természetes finom egyensúlya megváltozik, ami további érrendszeri és végszervi károsodáshoz járul hozzá. A károsodott endothelfunkcióról azt feltételezték, hogy egy végső közös útvonalat biztosít, amelyen keresztül számos kockázati tényező kifejti káros hatását a szív- és érrendszeri egészségre, és a kardiovaszkuláris kockázat erőteljes helyettesítő markereként bizonyították, hogy egy tanulmány még a Framingham-kockázati pontszámnál is jobb kiszámíthatóságot mutatott. Az EndoPAT 2000 készüléket használjuk, mivel ez az endothel funkció nem invazív módon történő becslésére szolgál.

   Nem végeztek közvetlen tanulmányokat a Hp genotípusok és az endothel funkció közötti összefüggés vizsgálatáról, egy kísérleti vizsgálatban, amelyben az endothel funkciót poszt-ischaemiás reaktív hiperémia és nyúlásmérő pletizmográfia segítségével értékelték, és egy ischaemiás periódus után maximális áramlásként fejezték ki. hogy a cukorbetegségben szenvedő Hp 2-2 betegek endothel funkciója rosszabb volt a nem Hp 2-2 betegekhez képest (450 +-50 versus 600 + -40).

   1.3 Haptoglobin genotípusok és CIMT (carotis intima media vastagsága)

   A Diabetes Heart tanulmányban a Hp genotípusok genetikai elemzése összefüggést mutatott ki a Hp 2-2 genotípus és a carotis intima media vastagsága (CIMT) között. Ezeket a méréseket az alany fekvő helyzetben, kinyújtott fejjel és a vizsgált nyaki verőérrel kissé elfordított fejjel végzik el, a mannheimi CIMT konszenzus ajánlásait követve. Két kutató 23 személyre becsülte meg a CIMT-t, és egy Bland-Altman parcellát készítettek. és a felhasználók közötti megállapodás határai -0,1 és +0,1 között vannak.

   1.4 Haptoglobin genotípusok és az aorta artéria merevsége

   Bár nem végeztek közvetlen vizsgálatokat a Hp genotípusok és az aorta artéria merevségének összehasonlítására, egy olyan vizsgálatot végeztek, amelyben pulzushullám kontúrelemző módszerrel értékelték a nagy és kis artériák artériás rugalmasságát. A nagy artériák rugalmassági indexe alacsonyabb volt a Hp 2-2-ben szenvedő betegeknél, mint a Hp 1-1-ben (8,4 ± 2,3 ml/Hgmm versus 12,6 ± 4,1 ml/Hgmm x 100; p

   Fokozott érmerevséget észleltek a 2-es típusú cukorbetegség korai szakaszában a sphygmocor készülékkel. Valószínű, hogy ez a merevség az endothel diszfunkcióhoz kapcsolódik, nem pedig a vaszkuláris szerkezeti elváltozásokhoz – ez viszont arra utal, hogy reverzibilis. Az aorta pulzushullám-sebessége (PWV), az aorta tágulási mutatója, szintén előrejelzi a mortalitást cukorbetegeknél, függetlenül az ismert zavaró tényezőktől. A SphygmoCor Xcel készülék az aorta artéria merevségének becslésére szolgál a nyaki verőér és a femorális pulzushullám sebesség és a központi aortanyomás segítségével. A kutatók 20 egyedben megbecsülik a pulzushullám sebességét annak érdekében, hogy a Bland-Altman diagram segítségével megállapítsák az egyetértési határokat a vizsgálat megkezdése előtt.

   1.5 Haptoglobin genotípusok és vaszkuláris markerek

   A vaszkuláris sejt adhéziós molekula-1 (VCAM-1) és az intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1) olyan fehérjék, amelyek az aktivált endothelsejtek (EC-k) felszínén expresszálódnak, és korai atherosclerosisban expresszálódnak. Ezeket a markereket értékelték és jó markereknek tekintik az endothel diszfunkcióra, mivel a fehérje egy része a keringésbe kerül, és kimutatható a perifériás plazmában.

   1.6 Haptoglobin genotípusok és a plazma lipidek fenotípusa

   A Hp 2-2 fenotípust magasabb oxidált LDL-koncentrációval társították, ami elsősorban az érelmeszesedésben játszik szerepet. Az Apo-A1 HDL koncentrációja szintén magasabb ebben a betegcsoportban. A Hp 2-2 fenotípus magasabb Lp(a)-koncentrációval is összefüggésbe hozható, ami magasabb kardiovaszkuláris kockázatnak teszi ki ezeket a betegeket. A plazma lipidek részletes fenotipizálása proteomika segítségével új asszociációkat keresve.

   1.7 Haptoglobin genotípusok és oxidatív stressz

   Ismeretes, hogy a Hp 2-2 genotípus nagyobb oxidatív stresszt okoz az endotéliumban. A teljes oxidációs potenciált az Oxidatív-INDEX-ként kell kiszámítani. Az index kiszámításához két tesztet kell elvégezni az alábbiak szerint. Ezt az indexet a teljes oxidatív stressz jó becsléseként állapították meg.

   1. d-ROM teszt: Ezt a tesztet szérummintákon hajtják végre automatizált d-ROM módszerrel. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Az oxidatív stressz pontszám a pro-oxidáns és antioxidáns megfelelők kombinált mérőszáma koszorúér-betegségben szenvedő betegeknél. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. A FRAP (plazma vasredukáló képessége – a plazma érkárosodást megelőző képességének mértéke) és a d-ROM-t (a reaktív oxigén metabolitok származékai) tesztet fogják használni az oxidatív stressz pontszámának kiszámításához.

   Az oxidatív stressz egyéb markereit is mérjük, mint például a glioxált, metilglioxált, aszimmetrikus dimetil-arginint és homoarginint.

   1.8 Haptoglobin genotípusok és retina Arteriovenosus index

   A retina mikrovaszkuláris rendellenességeinek jelenléte, különösen az artériák összehúzódása és a venula dilatáció, fokozott szív- és érrendszeri kockázattal, valamint endothel diszfunkcióval és gyulladással jár együtt. Jelenleg nincs olyan tanulmány, amely a Hp genotípusok és a retina arteriovenosus (AV) indexe közötti kapcsolatot vizsgálná. . A vizsgálatok előtt szemcseppeket csepegtetünk a pupillák tágítására a szemfenék vizsgálatához és a szaruhártya kenésére. A szemklinikán retina képalkotást készítenek az alanyok számára. Ha a betegek nem kívánnak részt venni a retina képalkotó vizsgálatban, dönthetnek úgy, hogy kilépnek a retina képalkotó vizsgálatból.

   2.0 E-vitamin, haptoglobin fenotípus és kardiovaszkuláris kockázat csökkentése

   Míg a Hp1 és Hp2 allél fehérjetermékek közötti funkcionális különbségek, különösen DM-ben, megmagyarázhatják a szövődményekre való hajlam különbségét a Hp 2-2 egyedek és a nem Hp 2-2 egyedek között, az E-vitamin egyedülálló előnyének fő oka az, hogy redox aktív Hb csak Hp 2-2 DM egyénekben kapcsolódik HDL-hez. A DM-ben szenvedő betegeknél a csökkent Hp-Hb komplexek fokozott Hp-Hb-kötődését eredményezik a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) Apo-A1-hez, ezáltal a prooxidatív hem molekularész a HDL-hez kötődik. A HDL a Hp 2-2 DM egyénekben nem képes stimulálni a koleszterinnek a makrofágokból való fordított átvitelét. Emellett a Hp 2-2 fenotípus fokozott oxidatív stresszel jár a szabad gyökök elégtelen kiürülése és a fokozott LDL-peroxidáció miatt.

   Az E-vitamin erős antioxidáns, gyulladásgátló tulajdonságokkal. Jelentősen enyhíti az oxidatív stressz állapotát mind erőteljes szabad gyökfogó tulajdonságával, mind az antioxidáns enzimekkel való közvetlen és erős kölcsönhatás révén. Az E-vitamin-kiegészítés ember- és állatmodellekben kimutatták, hogy csökkenti a lipid-peroxidációt, a szuperoxid-termelést és a scavenger receptorok (SR-A és CD36) expresszióját, amelyek különösen fontosak a habsejtek kialakulásában. Bár az E-vitamin nem bizonyult hasznosnak a szív- és érrendszeri kockázat csökkentésében az általános populációban, hasznos volt a Hp 2-2 fenotípusú DM-ben szenvedő betegeknél, amelyek mindkét állapot jelentősen növeli az oxidatív stresszt egy populáción végzett vizsgálatok szerint.

   Mindössze három intervenciós randomizált kontrollált vizsgálatot (RCT) végeztek, amelyekben az egyetlen antioxidáns, amelyet a DM résztvevők kaptak, az E-vitamin volt, és amelyekben meghatározták a vizsgálatban résztvevők Hp típusát. Az ICARE vizsgálat volt az egyetlen RCT, amelynek célja az E-vitamin értékelése olyan DM-es betegeknél, akiknél prospektívan gyűjtötték a Hp genotípust. Ebben a vizsgálatban 1434 Hp 2-2 fenotípusú, 55 évesnél idősebb DM egyént randomizáltak E-vitaminra (400 NE/nap/placebo). Az elsődleges összetett eredmény szignifikánsan csökkent az E-vitamint kapó egyéneknél (2,2%) a placebóhoz képest (4,7%, p=0,001) a vizsgálat megkezdése után 18 hónappal, amikor azt befejezték. Ezenkívül a WHS- és HOPE-vizsgálatokhoz toborzott betegek egy részéből vett vérmintákat elemezték a Hp-polimorfizmus szempontjából, és az eredményeket a páciens Hp-típusának megfelelően újraértékelték. Mindezekben a vizsgálatokban a szív- és érrendszeri események magasabb kockázatát észlelték a Hp 2-2 betegeknél, és ebben a csoportban az E-vitamin-kiegészítés előnyeit tapasztalták.

   2.1 Az E-vitamin (alfa-tokoferol) adagjának és időtartamának indoklása.

   Napi 400 NE E-vitamint és megfelelő placebót fogunk használni. Megbízzuk a Beacons céget, aki elkészíti az E-vitamin kapszulákat (400 NE) és a hozzá tartozó placebo kapszulákat. Az E-vitamin készítmény az RRR-konfigurációban előforduló természetes tokoferol lesz. 400 NE E-vitamint fogunk adni 6 hónapig, mivel a legtöbb, a szív- és érrendszeri kockázat helyettesítő markereit használó tanulmány javulást mutatott a kiegészítést követő 6 hónapon belül. Ezenkívül a fent említett ICARE vizsgálatban a kardiovaszkuláris kimenetel javulását észlelték 18 hónapos korban, ami arra utal, hogy a 6 hónapnak megfelelő időtartamnak kell lennie ahhoz, hogy javuljanak a kardiovaszkuláris kockázat helyettesítő markerei.

   Az E-vitamin nyolc formáját két csoportra osztják; négy tokoferol és négy tokotrienol. Ezeket az alfa- (α-), béta- (β-), gamma- (γ-) és delta- (δ-) előtagokkal azonosítják. Az alfa-tokoferol a természetben a legelterjedtebb forma, amelyről ismert, hogy a magzati igénybevételi vizsgálatok alapján a legmagasabb biológiai aktivitással rendelkezik, és visszafordítja az E-vitamin-hiány tüneteit az emberben. A természetes tokoferolok csak az RRR-konfigurációban fordulnak elő. A szintetikus forma nyolc különböző sztereoizomert tartalmaz, és „all-rac”-α-tokoferolnak nevezik.

   Az E-vitamin természetes formájában megtalálható növényi olajokban (búzacsíra-, napraforgó-, pórsáfrány-, kukorica- és szójaolaj), diófélékben (mandula, földimogyoró és mogyoró), magvakban (napraforgómag), zöld leveles zöldségekben (spenót és brokkoli) és dúsított formában. reggeli gabonapelyhek, gyümölcslevek, margarin és kenhető. Az Orvostudományi Intézet által ajánlott bevitel egyének számára körülbelül 15 mg/nap. Az E-vitamin-kiegészítők legmagasabb biztonságos szintje felnőttek számára 1500 NE/nap az E-vitamin természetes formái esetében, és 1000 NE/nap a mesterséges (szintetikus) formájú E-vitamin esetében. A népszerű E-vitamin-kiegészítők közé tartozik a D-alfa tokoferol, amely természetes olajokból származik. A kereskedelemben kapható E-vitamin-kiegészítők általában csak alfa-tokoferolt tartalmaznak, vagy nem észterezve, vagy acetát-, szukcinát- vagy nikotinát-észterként. Emberben a szabad és az észterezett alfa-tokoferol biológiai hozzáférhetősége azonos. A kiegészítők tartalmazhatnak természetes RRR-t vagy szintetikus (all-rac) alfa-tokoferolt. A természetes RRR alfa-tokoferol biológiai aktivitása magasabb, mint a szintetikus all-rac-alfa-tokoferol és az E-vitamin más természetes formáié.

   Mind az oxidatív stressz, mind az egyéni genetikai felépítés hozzájárul az E-vitamin homeosztázisához az emberben, és ez lehet felelős a klinikai vizsgálatok során a klinikai változók javulása során tapasztalt változó klinikai hatásokért. Az E-vitamin a bélben felszívódik, a nyirokrendszeren keresztül kerül a keringésbe, ahol a lipidekkel együtt felszívódik, kilomikronokba csomagolva a májba kerül. A májon való átjutás után elsősorban csak az alfa-tokoferol jelenik meg a plazmában, és az E-vitamin egyéb formáinak többsége elsősorban metabolizálódik, és vagy az epével választódik ki, vagy nem szívódik fel és ürül ki a széklettel. A májban a máj alfa-tokoferol transzfer fehérje (α-TTP) specifikusan választja ki az α-formát a 2R-sztereoizomerekkel. A plazma RRR-α-tokoferol beépülése telíthető folyamat. Az RRR-α-tokoferol plazmaszintje körülbelül 80 μM-nál nem emelkedik, annak ellenére, hogy az E-vitamin-kiegészítés napi 1320 mg-ig emelkedik. Ez valószínűleg másodlagos a keringés újonnan felszívódó α-tokoferollal történő gyors helyettesítése miatt, és a kinetikai elemzések azt mutatják, hogy az α-tokoferol teljes mennyisége naponta cserélődik. Emberben az α-tokoferol preferenciális felhalmozódása a szervezetben mind a funkcionális α-TTP-től, mind a nem-α-tokoferolok fokozott metabolizmusától és kiválasztásától függ. Az alfa-tokoferol transzfer fehérje szabályozza az egész testben az E-vitamin eloszlását és koncentrációját azáltal, hogy szabályozza az E-vitamin májból történő kiválasztását. Azt tapasztalták, hogy az alfa-tokoferol transzfer fehérje gén expresszióját indukálhatja oxidatív stressz és hipoxia, a nukleáris receptor PPARα és RXR agonistái, valamint a cAMP szint növelése. Ezt egy már meglévő transzkripciós faktor, az úgynevezett cAMP válaszelem-kötő (CREB) transzkripciós faktor közvetíti. Az egészséges emberekben gyakran előforduló egynukleotidos polimorfizmusok drasztikusan befolyásolják a promoter aktivitását.

   A klinikai vizsgálatok során különböző dózisú E-vitamint alkalmaztak 400 NE és 2000 NE között. Az Egyesült Államok Orvostudományi Intézete 15-1000 mg/nap (1 mg = 1,5 NE; 22,5-1500 NE/nap) javasolt étrendi bevitelt (RDA) javasol. 400 NE adagot használunk hat hónapig. Az RDA-n belüli bevétel esetén nincs bizonyíték a káros hatásokra, azonban nagy dózisok esetén vérzéses toxicitás léphet fel, különösen az antikoagulánsokat szedő betegeknél. Ezért az antikoagulánsokat szedő betegeket kizárjuk.

   3.0 Statisztikai megfontolások

   3.1 A minta méretének kiszámítása: A vizsgálat teljes becsült mintanagysága 300 beteg. Az RCT fázis minden egyes Hp fenotípusú rétegéhez szükséges 100 mintanagyság a következőkön alapul: 5% I. típusú hiba; 90% teljesítmény; az a feltételezés, hogy az E-vitamin várhatóan legalább mérsékelt hatást fejt ki, amelyet egy 0,5-ös standardizált hatásméret (átlagkülönbség/összevont standard hiba) képvisel minden egyes kockázati markerre; kétmintás t-próba egyenlő szórással; és 15%-os lemorzsolódás. Feltételezve, hogy populációnkban a Hp 2-2 prevalenciája 35%, 300 beteget kell kiszűrnünk, hogy 100 Hp 2-2 fenotípusú beteget toborozhassunk.

   Feltételezve, hogy az RHI átlagos különbsége 0,25 egység, a megfelelő szórással (SD) 0,3 - a standardizált hatásméret 0,25/0,3 = 0,83, mint egy másik vizsgálatban észlelt minimális eltérés az RHI-ben. Nem alkalmazkodtunk a többszöri teszteléshez/összehasonlításhoz az RCT kísérleti jellege, valamint általában véve a vizsgálat feltáró jellege miatt.

   Az in vitro vizsgálat mintanagyságát a korlátozott erőforrások korlátozzák. Mindazonáltal a kétoldalas Wilcoxon Signed-Ranked teszten, 5%-os I-es típusú hibán, a párok közötti 0,5-ös korreláción és 5000 Monte Carlo szimulációs mintán alapuló szimulációs eredmények azt mutatják, hogy 20 pár megfelelő teljesítményt biztosít közepes és nagy szabványos hatásméretek kimutatásához. (M1).

   A véletlenszerű besorolás elektronikus úton történik a weben – egy központi, jelszóval védett intranetes weboldalon, amely biztosítja, hogy a betegek véletlenszerű besorolása akkor történjen, amikor jogosultak a vizsgálatra (szigorúan egymás után). A vizsgálathoz blokkolt randomizációs ütemtervet alkalmazunk, 10-es blokkokban, 1:1 elosztási arányon alapulva. A dedikált, jelszóval védett webhely ezután egyedi betegvizsgálati számot rendel, amely megfelel a gyógyszeres dobozokban feltüntetett kezelési számoknak. A véletlen besorolást követően az első adagot beadják a betegnek.

   3.2 Adatkezelés és statisztikai elemzések: Adatkezelés Minden releváns adatot a megfelelő, jól megtervezett vizsgálati adatgyűjtési űrlapokon kell összegyűjteni minden egyes látogatás és telefonos nyomon követés során. Minden vizsgálati adatot egy vizsgálati adatbázisban tárolnak, amely csak az adatbevitellel és az adatérvényesítéssel foglalkozó személyzet számára értékelhető.

   Statisztikai elemzési terv A kiindulási demográfiai és klinikai változókra, valamint a kockázati markerekre vonatkozó adatokat a Hp fenotípusok szerint összegzik, és összességében betekintést nyújtanak a lehetséges összefüggésekre. A bináris adatok összegzése gyakoriság és arányok használatával történik. Khi-négyzet tesztet és Fisher egzakt tesztet használnak a releváns összefüggések (beleértve az E-vitamin előnyeit) értékelésére, és szükség esetén logisztikus regressziót alkalmaznak az asszociációk jellemzésére, miközben a lehetséges zavaró tényezőkhöz igazítják. A folytonos változókat a megfelelőnek ítélt átlagok (szórás) vagy medián (tartomány) segítségével összegzik. Két minta t-próbát vagy Mann-Whitney tesztet használunk a releváns asszociációk értékelésére, és általános lineáris modelleket használunk az asszociációk jellemzésére, miközben a lehetséges zavaró tényezőkhöz igazítjuk. Az általánosított lineáris modelleket úgy tekintjük, hogy szükség esetén nem normál (aszimmetrikus) vagy log-normális adatokat (például laboratóriumi adatokat) is befogadhatnak. Minden releváns eredményhez külön teszteket és modelleket kell végezni.

   Az in vitro vizsgálatból származó adatokat az előző bekezdésben leírtakhoz hasonlóan a Hp 2-2 fenotípus állapota és az E-vitamin koncentrációja alapján foglaljuk össze. A Wilcoxon Signed-Ranked tesztet az E-vitamin előnyeinek a Hp fenotípusú csoportok közötti koncentráció szerinti értékelésére fogják használni. Mann-Whitney és Jonckheere-Terpstra tesztet használnak az E-vitamin koncentráció-előny kapcsolatának értékelésére a Hp fenotípusú csoportok szerint. Általánosított lineáris vegyes modelleket alkalmazunk a különböző trendek és összefüggések feltárására, miközben figyelembe veszik (i) a Hp 2-2 és nem Hp 2-2 betegek egyezését, (ii) az ismételt értékelést egy páciensen belül az E-vitamin koncentrációja alapján, (iii) a lehetséges zavaró tényezők kiigazítása, és (iv) az adatok esetleges nem-normalitása (aszimmetria) kiigazítása más megfelelő eloszlások, például log-normális vagy gamma eloszlások használatával. El kell végezni az in vitro vizsgálatokból származó adatok átfogó elemzését.

   A Bland-Altman analízis segítségével megbecsülik és értékelik az egyetértési és megbízhatósági vizsgálatok egyezési határait. Adott esetben vegyes modelleljárást alkalmaznak a vonatkozó megbízhatósági együtthatók becslésére és értékelésére.

   5.0 Klinikai jelentősége

   Ha összefüggést találunk a Hp 2-2 fenotípus és a kardiovaszkuláris kockázat között, akkor ez a betegcsoport a sztatinok mellett az E-vitamin-kezelést és más hagyományos kezelést is megcélozhatja a kardiovaszkuláris kockázat csökkentése érdekében. Tervezhető a jövőbeni nagyszabású országos RCT annak megállapítása, hogy az E-vitamin-kezelés segít-e csökkenteni a kockázatot ebben a betegcsoportban. Az ilyen tanulmányok elvégzése egy többnemzetiségű populáción elengedhetetlen, mivel betekintést nyújt a várható előnyök következetességébe és általánosíthatóságába.