Forholdet mellem Haptoglobin-fænotype og vaskulær funktion og respons på vitamin E-tilskud hos patienter med diabetes mellitus type 2: EVAS-forsøget (EVAS)

1.0 Baggrund og klinisk betydning 1.1 Indledning Forekomsten af ​​diabetes mellitus type 2 (DM2) vokser hurtigt globalt og i Singapore. Hovedårsagen til øget morbiditet og dødelighed hos patienter med DM2 er udviklingen af ​​mikrovaskulære og makrovaskulære komplikationer. Selvom streng glykæmisk kontrol har vist sig at reducere mikrovaskulære komplikationer, mangler beviserne stadig med hensyn til makrovaskulære komplikationer. Accelereret åreforkalkning er den førende årsag til øget dødelighed og morbiditet hos disse patienter. Det er af afgørende betydning at vurdere nye mål til at kontrollere åreforkalkning hos patienter med DM2 oven i konventionel behandling. Der er et udækket behov for at finde nye mål eller markører, der forudsiger øget risiko hos patienter med diabetes mellitus, og vi er nødt til at overveje alternative behandlinger ud over konventionelle mål for at reducere risikoen hos disse patienter i højrisikogruppen.

Patienter med DM2 har ikke kun en øget risiko for åreforkalkning, de bærer også en større grad af sygdomsbyrden. Endothelial dysfunktion anses for at være kendetegnet ved den patologiske fornærmelse, der påføres blodkarrene. Hyperglykæmi påvirker mitokondrielle, enzymatiske og ikke-enzymatiske veje forbundet med dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), hvilket fører til nedsat nitrogenoxidbiotilgængelighed og endotel dysfunktion, almindeligvis påvist ved reduceret endotelafhængig vasodilatation og øgede plasmaniveauer af endotelafledte regulatoriske proteiner. Desuden har DM2-patienter kompromitteret antioxidantforsvaret i form af lave niveauer af antioxidantenzymer og alfa-tocopherol (vitamin E), hvilket kan hindre en passende kompensation for stigningen i oxidativt stress. En anden rolle af oxidativt stress i at mediere udviklingen af ​​åreforkalkning er også blevet demonstreret i den oxidative hypotese. I denne model er det mest fremtrædende mål for oxidativ modifikation LDL-molekylet. Oxideret LDL genkendes ikke af LDL-receptoren, men optages let af CD36 scavenger-receptor-vejen i makrofager, hvilket fører til mærkbar kolesterylesterakkumulering og skumcelledannelse. Oxideret LDL er proinflammatorisk, det forårsager hæmning af endothelial NO-syntetase, fremmer vasokonstriktion og monocytadhæsion og fremmer blodpladeaggregation og trombose.

Hp fænotype og oxidativ vævsskade

Haptoglobin (Hp) proteinet er en antioxidant på grund af dets evne til at neutralisere hæmoglobinets (Hb) oxidative aktivitet. Hos mennesker er Hp karakteriseret ved en genetisk polymorfi med tre strukturelt forskellige fænotyper (Hp1-1, Hp 2-1 og Hp 2-2, som er et resultat af ekspression af to forskellige alleler (Hp 1 og Hp 2) af haptoglobingenet placeret på kromosom 16q22. Proteinproduktet af Hp2-allelen er en ringere antioxidant sammenlignet med Hp1-allelproduktet. Hp 1-1 er et lille molekyle (86 kDa) med veldefineret struktur, hvorimod Hp 2-1 er karakteriseret ved heteropolymerer (86-300 kDA), og Hp 2-2 danner store makromolekylære komplekser (170-1.000 kDa).

Hp's funktion er at binde frit Hb frigivet fra røde blodlegemer, som frigives til blodet under den naturlige omsætning af røde blodlegemer. Frit Hb er i stand til at forårsage betydelig oxidativ vævsskade som følge af dets hæmjern. Men hver gang Hb frigives til kredsløbet, binder det straks til Hp med ekstrem høj affinitet til at danne et Hp-Hb-kompleks. Denne binding tjener til at hæmme det oxidative potentiale af Hb ved at forhindre frigivelsen af ​​hæmjern fra Hb. Hp findes normalt i blodet i et mere end 400 gange molært overskud til frit Hb, og derfor er Hp i stand til at binde alt det Hb, der frigives under normal omsætning af røde blodlegemer. Når først Hb er bundet til Hp, fjernes det hurtigt fra blodstrømmen via CD163 scavenger-receptoren udtrykt på monocytter/makrofager, dog er dannelse og clearance af Hp-Hb-komplekser svækket i Hp 2-2-fænotyper.

Jern afledt af Hb kan katalysere en række oxidative reaktioner, som kan hæmmes af Hp.

1. Jernholdigt hæmjern (Fe2+) kan reagere med hydrogenperoxid og give ferri-Hb (Fe3+) og de meget reaktive hydroxylradikalarter. Ved at udvinde et hydrogenatom fra flerumættede fedtsyrer kan hydroxylradikaler starte processen med lipidperoxidation.
2. Jernholdig Hb (Fe2+) kan også reagere med hydrogenperoxid for at producere ferryl Hb (Fe4+), et meget ustabilt molekyle, som let reagerer med et andet molekyle af hydrogenperoxid for at give jern-Hb (Fe3+) og superoxidanion. De skadelige virkninger af superoxidanion er dobbelt: reduktion af ferrijern (Fe3+) i Hb til ferrojern (Fe2+), hvilket muliggør produktion af yderligere hydroxylradikal som beskrevet i reaktion 1, og dismutation af superoxidanion for at producere hydrogenperoxid , igen fremme af produktionen af ​​ROS.

3. Ferri-Hb (indeholdende Fe3+), også kendt som methæmoglobin, kan spontant overføre sin hæm-del, hvilket resulterer i, at hæm trænger ind i forskellige lipofile miljøer såsom LDL eller cellemembraner. Når det først er interkaleret i dets nye lipidmiljø, kan hæmjern undergå reaktioner med hydrogenperoxid som beskrevet ovenfor eller med tilstødende lipidperoxider, hvilket genererer en fri radikal-kaskade og fører til omfattende lipidoxidation.

   Som en del af Hp-Hb-komplekset stabiliserer Hp hæm i hæmlommen på Hb og forhindrer Hb i at forårsage oxidativ skade. Imidlertid er graden, hvormed Hp neutraliserer redoxaktiviteten af ​​hæmjern, forskellig mellem Hp-typer. Dette er blevet vist i en række systemer både in vitro og in vivo. For eksempel viste undersøgelser med linolensyre, at Hp 1-1 forhindrede oxidation (diendannelse) målt ved en stigning i absorbans ved 232 nm i højere grad end Hp 2-2. En anden undersøgelse undersøgte LDL-oxidation på grund af hæmoverførsel fra Hb til LDL. Hæmoverførsel blev målt ved quenching af fluorescenssignalet udsendt af dansyleret LDL. Det blev fundet, at Hp 1-1 var overlegen til at forhindre hæmoverførsel fra Hb sammenlignet med Hp 2-2.

   Hp-fænotyper og kardiovaskulære risikostudier har vist, at Hp 2-2 Hb-komplekser også fjernes mindre effektivt end ikke-Hp 2-2 Hb-komplekser. Hos DM2-patienter er dette fænomen mere udtalt på grund af nedreguleringen af ​​CD163, især hos Hp 2-2-individer. En svækkelse af anti-inflammatorisk makrofagsignalering gennem en CD163/pAkt /IL-10 akse ses også hos Hp 2-2 patienter.

   Hp-Hb-manglende clearance hos Hp 2-2 DM2-individer resulterer i øget Hp-Hb-binding til Apo A1 på high-density lipoprotein (HDL-C), hvorved den pro-oxidative hæm-del bindes til HDL. Dette gør det mangelfuldt i dets evne til at vende overførsel af kolesterol fra makrofager.

   Hp 2-2-proteinet er mindre effektivt til at blokere hæmoverførsel fra Hb sammenlignet med Hp 1-1. Ydermere kan stigningen i hæmoverførsel, når Hb er glycosyleret, give en mekanistisk forklaring på stigningen i hjerte-kar-sygdom, der ses i Hp 2-2 DM2.

   Derfor er Hp 2-2 fænotype forbundet med nedsat evne til at binde til Hb, nedsat clearance af Hp 2-2 Hb komplekser, svækkelse af anti-inflammatorisk signalvej, øget LDL oxidation, gør HDL-kolesterol ineffektiv og mindre effektiv til at blokere hæmoverførsel fra Hb til Hp 1-1, hvilket alt sammen fører til en højere kardiovaskulær risiko. Hos diabetespatienter, hvor nogle af disse veje også påvirkes, forværres den synergetiske virkning af hyperglykæmi og haptoglobin-fænotype, hvilket fører til højere risiko.

   I longitudinelle undersøgelser udført i andre populationer er det blevet set, at Hp 2-2 genotype er forbundet med en 2-5 gange øget risiko for hændelig CVD hos personer med DM. Især undersøgelsen af ​​stærkt hjerte var oddsratioen for at have CVD i DM med Hp 2-2 fænotypen 2-5 gange større end i DM med Hp 2-1 fænotype (p=0,002). I Munich Stent-studiet blev en på hinanden følgende serie af 935 behandlede diabetikere fulgt op i et år efter stenting for alvorlige uønskede hjertehændelser. I denne undersøgelse blev haptoglobin 2-2-fænotypen set at være en uafhængig forudsigelse af alvorlige uønskede hjertehændelser. Derudover er det blevet set, at E-vitamin giver betydelig kardiovaskulær fordel for Hp 2-2 DM-patienter i én population (Israel-ICARE STUDY) og post-hoc analyse af WHS (Women Health Study) og HOPE undersøgelsen for at se, om Vitamin E-tilskud i undergruppe af patienter med den haptoglobin 2-2 fænotype påvirket dødelighed viste en ikke-signifikant reduktion i total dødelighed. Dette er ikke blevet bredt vedtaget, da større forsøg og på flere populationer er nødvendige for at underbygge sammenhængen og fordelene.

   Hp fænotype og etnicitet

   I en lokal undersøgelse udført i Singapore er det blevet set, at frekvensen af ​​Hp-generne varierer i de forskellige etniciteter som følger: Kinesisk Hp1:0.330;Hp2:0.670;Hp0: 0,029; Malaysisk:Hp1:0,298;Hp2:0,702 ;Hp0:0,004; Indianere Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. Fordelingen af ​​Hp-frekvenserne har vist sig at være ved Hardy-Weinberg-ligevægt i vores befolkning, hvorfor den forventede prævalens af Hp 2-2 er omkring 30-40%. Hp-fænotyperne vil blive bestemt ved TaqMan-analyse på TTSH Research Laboratory.

   1.2 Haptoglobin genotyper og endotelfunktion

   Endothelial dysfunktion har fået stigende opmærksomhed som en potentiel bidragyder til patogenesen af ​​vaskulær sygdom i DM. I DM2 ændres den naturlige delikate balance i endotelets frigivelse af kontrakterende og afslappende faktorer, hvilket bidrager til yderligere vaskulær og endeorganskade. Nedsat endotelfunktion er blevet postuleret at give en endelig fælles vej, hvorved flere risikofaktorer udøver deres skadelige virkninger på kardiovaskulær sundhed og er blevet etableret som en kraftfuld surrogatmarkør for kardiovaskulær risiko med en undersøgelse, der viser endnu bedre forudsigelighed end Framingham risikoscore. EndoPAT 2000-enheden vil blive brugt, da denne er blevet etableret til estimering af endotelfunktionen på en ikke-invasiv måde.

   Der er ingen direkte undersøgelser udført på at se på en association af Hp-genotyper til endotelfunktion, i et pilotstudie, hvor endotelfunktionen blev vurderet ved hjælp af post-iskæmisk reaktiv hyperæmi og strain gauge plethysmografi og udtrykt som maksimal flow efter en iskæmisk periode, blev det set. at Hp 2-2 patienter med diabetes havde dårligere endotelfunktion sammenlignet med ikke Hp 2-2 patienter (450 +-50 versus 600+-40).

   1.3 Haptoglobin genotyper og CIMT (carotid intima media thickness)

   I Diabetes Heart-undersøgelsen viste genetiske analyser af Hp-genotyper en sammenhæng mellem Hp 2-2-genotype og carotis intima media thickness (CIMT). Disse målinger vil blive foretaget med forsøgspersonen liggende, med hovedet strakt og let vendt modsat carotis undersøgt, i overensstemmelse med anbefalingerne fra Mannheim CIMT konsensus. To forskere har estimeret CIMT i 23 personer, og et Bland-Altman plot blev plottet. og grænserne for aftale mellem brugere blev fundet at ligge inden for -0,1 til +0,1.

   1.4 Haptoglobin-genotyper og aortaarteriestivhed

   Selvom der ikke er foretaget direkte undersøgelser, der sammenligner Hp-genotyper og aortaarteriestivhed, blev der udført en undersøgelse, hvor de evaluerede den arterielle elasticitet af store og små arterier ved hjælp af pulsbølgekonturanalysemetoden. Det store arterielasticitetsindeks var lavere hos patienter med Hp 2-2 sammenlignet med Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg versus 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   Øget vaskulær stivhed er blevet set tidligt i forløbet af diabetes mellitus type 2 ved brug af sphygmocor-anordning. Det er sandsynligt, at denne stivhed er relateret til endoteldysfunktion snarere end strukturelle vaskulære ændringer - dette tyder igen på, at det er reversibelt. Aortapulsbølgehastighed (PWV), et mål for aortadistenibilitet, er også blevet set at forudsige dødelighed hos patienter med diabetes uafhængigt af kendte forstyrrende faktorer. SphygmoCor Xcel-enheden til at estimere aortaarteriestivheden ved hjælp af carotis til femoral pulsbølgehastighed og det centrale aortatryk vil blive brugt. Forskerne vil estimere pulsbølgehastigheden hos 20 individer for at etablere grænserne for overensstemmelse ved hjælp af Bland-Altman-plottet, før undersøgelsen påbegyndes.

   1.5 Haptoglobin genotyper og vaskulære markører

   Vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1) og intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) er proteiner udtrykt på overfladen af ​​aktiverede endotelceller (EC'er) og udtrykt i tidlig aterosklerose. Disse markører er blevet evalueret og betragtet som gode markører for endothelial dysfunktion, fordi en del af proteinet udskilles i kredsløbet og kan påvises i perifert plasma.

   1.6 Haptoglobin-genotyper og fænotypning af plasmalipider

   Hp 2-2 fænotype er blevet forbundet med højere oxiderede LDL-koncentrationer, som primært er involveret i åreforkalkning. Koncentrationerne af Apo-A1 HDL er også kendt for at være højere i denne gruppe af patienter. Hp 2-2-fænotype kan også være forbundet med højere Lp(a)-koncentrationer, hvilket sætter disse patienter i højere kardiovaskulær risiko. Detaljeret fænotypning af plasmalipider ved hjælp af proteomik til at lede efter nye associationer vil blive udført.

   1.7 Haptoglobin genotyper og oxidativ stress

   Det er kendt, at Hp 2-2 genotype giver en højere oxidativ stress på endotelet. Det samlede oxidativt potentiale vil blive beregnet som Oxidativ-INDEX. To tests vil blive udført som følger for at beregne dette indeks. Dette indeks er blevet etableret som et godt estimat for det samlede oxidative stress.

   1. d-ROMs test: Denne test vil blive udført på serumprøver ved at bruge automatiseret d-ROMs metode. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. En oxidativ stress-score som et kombineret mål for pro-oxidant- og anti-oxidant-modstykker hos patienter med koronararteriesygdom. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (ferric reducing ability of plasma - et mål for plasmaets evne til at forhindre skade på kar) og d-ROM'er (derivater for Reactive Oxygen Metabolites) test vil blive brugt til at beregne den oxidative stress score.

   Andre markører for oxidativ stress vil også blive målt, såsom glyoxal, methylglyoxal, asymmetrisk dimethylarginin og homoarginin.

   1.8 Haptoglobin-genotyper og retinalt arteriovenøst ​​indeks

   Tilstedeværelsen af ​​retinale mikrovaskulære abnormiteter, især arteriel konstriktion og venulær dilatation, har været forbundet med en øget kardiovaskulær risiko og har været forbundet med endothelial dysfunktion og inflammation. Der er i øjeblikket ingen undersøgelser, der ser på forholdet mellem Hp-genotyper og retinalt arteriovenøst ​​(AV)-indeks. . Forud for undersøgelserne vil der blive inddryppet øjendråber til at udvide pupillerne til fundusundersøgelse og til at smøre hornhinden. Der vil blive foretaget retinal billeddannelse af forsøgspersonerne på øjenklinikken. Hvis patienter ikke ønsker at deltage i retinal billeddannelse, kan de vælge at fravælge retinal billeddiagnostik.

   2.0 Vitamin E, haptoglobin fænotype og kardiovaskulær risikoreduktion

   Mens funktionelle forskelle mellem Hp1 og Hp2 allelproteinprodukter, især i DM kan forklare forskellene i modtagelighed for komplikationer hos Hp 2-2 individer fra ikke Hp 2-2 individer, er hovedårsagen til den unikke fordel ved E-vitamin, at redoxaktivt Hb er kun forbundet med HDL hos Hp 2-2 DM individer. Hos patienter med DM resulterer nedsatte Hp-Hb-komplekser i øget Hp-Hb-binding til Apo-A1 på high-density lipoprotein (HDL), hvorved den pro-oxidative hæm-del bindes til HDL. HDL i Hp 2-2 DM-individer er mangelfuld i sin evne til at stimulere den omvendte overførsel af kolesterol fra makrofager. Udover disse er Hp-fænotypen 2-2 forbundet med øget oxidativt stress på grund af mangelfuld clearance af frie radikaler og øget LDL-peroxidation.

   E-vitamin er en potent antioxidant med anti-inflammatoriske egenskaber. Det lindrer væsentligt tilstanden af ​​oxidativt stress ved både dets potente frie radikalfjernende egenskaber og ved at interagere direkte og stærkt med antioxidantenzymer. Vitamin E-tilskud i mennesker og dyremodeller har vist sig at reducere lipidperoxidation, superoxidproduktion og mindske ekspressionen af ​​scavenger-receptorer (SR-A og CD36), som er særligt vigtige i dannelsen af ​​skumceller. Selvom E-vitamin ikke har vist sig at være nyttigt til at reducere kardiovaskulær risiko i den generelle befolkning, har det været nyttigt hos patienter med Hp 2-2 fænotype med DM, begge tilstande, der øger oxidativt stress væsentligt i undersøgelser udført i en population.

   Der har kun været tre interventionelle randomiserede kontrollerede forsøg (RCT'er), hvor den eneste antioxidant, som DM-deltagerne fik, var E-vitamin, og hvor Hp-typen af ​​studiedeltagere blev bestemt. ICARE-undersøgelsen var den eneste RCT, der havde til formål at evaluere E-vitamin hos DM-patienter, for hvilke Hp-genotypen prospektivt blev indsamlet. I denne undersøgelse blev 1.434 DM-individer > eller = 55 år med Hp 2-2-fænotypen randomiseret til E-vitamin (400 IE/dag/placebo). Det primære sammensatte resultat var signifikant reduceret hos personer, der fik E-vitamin (2,2 %) sammenlignet med placebo (4,7 %, p=0,001) 18 måneder efter påbegyndelse af forsøget, da det blev afsluttet. Derudover blev blodprøver fra en undergruppe af patienter rekrutteret til WHS- og HOPE-studierne analyseret for Hp-polymorfi, og resultaterne revurderet i henhold til patientens Hp-type. I alle disse undersøgelser blev der set en højere risiko for kardiovaskulære hændelser hos Hp 2-2 personer, og en fordel for E-vitamintilskud blev set i denne gruppe.

   2.1 Begrundelse for dosis og varighed af vitamin E (alfa-tocopherol).

   Vi vil bruge vitamin E 400 IE om dagen og matchet placebo. Vi bestiller firmaet Beacons, som vil forberede E-vitaminkapslerne (400 IE) og de matchende placebokapsler. Vitamin E præparat vil være det naturlige tocopherol, som forekommer i RRR-konfigurationen. Vi vil give E-vitamin 400 IE i 6 måneder, da de fleste undersøgelser med surrogatmarkører for kardiovaskulær risiko har set en forbedring i 6 måneder efter tilskud. I ovennævnte ICARE-undersøgelse blev der desuden set en forbedring i kardiovaskulært resultat efter 18 måneder, hvilket tyder på, at 6 måneder burde være tilstrækkelig varighed til at se en forbedring i surrogatmarkører for kardiovaskulær risiko.

   De otte former for E-vitamin er opdelt i to grupper; fire er tocopheroler og fire er tocotrienoler. De identificeres med præfikser alfa- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) og delta- (δ-). alfa-tocopherol er den mest udbredte form i naturen, kendt for at have den højeste biologiske aktivitet baseret på føtale resortion-assays og reverserer vitamin E-mangelsymptomer hos mennesker. Naturlige tocopheroler forekommer kun i RRR-konfigurationen. Den syntetiske form indeholder otte forskellige stereoisomerer og kaldes 'all-rac'-α-tocopherol.

   E-vitamin findes i sin naturlige form i vegetabilske olier (hvedekim-, solsikke-, saflor-, majs- og sojaolie), nødder (mandler, jordnødder og hasselnødder), frø (solsikkefrø), grønne bladgrøntsager (spinat og broccoli) og berigede morgenmadsprodukter, frugtjuice, margarine og smørepålæg. Institut for Medicin anbefalede indtag for enkeltpersoner er omkring 15 mg/dag. Det højeste sikre niveau af E-vitamintilskud til voksne er 1.500 IE/dag for naturlige former for E-vitamin og 1.000 IE/dag for den menneskeskabte (syntetiske) form. Populære vitamin E kosttilskud til rådighed inkluderer, D-alfa tocopherol, som er afledt af naturlige olier. Kommercielt tilgængelige vitamin E-tilskud indeholder normalt kun alfa-tocopherol, enten uesterificeret eller som esteren af ​​acetat, succinat eller nikotinat. Hos mennesker har fri og esterificeret alfa-tocopherol den samme biotilgængelighed. Kosttilskud kan indeholde enten den naturlige RRR- eller syntetisk (all-rac) alfa-tocopherol. Den biologiske aktivitet af naturligt RRR alpha-tocopherol er højere end for syntetisk all-rac-alpha-tocopherol og andre naturlige former for vitamin E.

   Både oxidativ stress og individuel genetisk sammensætning bidrager til E-vitamin-homeostase hos mennesker, og dette kan være ansvarligt for de variable kliniske effekter, der ses i forbedring af kliniske variabler i kliniske forsøg. E-vitamin optages i tarmen, kommer ind i kredsløbet via lymfesystemet, hvor det absorberes sammen med lipider, pakkes ind i chylomikroner og transporteres til leveren. Efter passage gennem leveren optræder kun alfa-tocopherol fortrinsvis i plasmaet, og de fleste af de andre former for E-vitamin metaboliseres fortrinsvis og enten udskilles i galden eller optages og udskilles ikke i fæces. I leveren sorterer hepatisk alfa-tocopherol-overførselsprotein (α-TTP) specifikt α-formen fra med 2R-stereoisomererne. Plasma RRR-α-tocopherol inkorporering er en mættelig proces. Plasmaniveauer af RRR-α-tocopherol holder op med at stige ved ca. 80 μM på trods af stigende doser af vitamin E-tilskud på op til 1.320 mg all-rac-α-tocopherol pr. dag. Dette er sandsynligvis sekundært til den hurtige udskiftning af cirkulerende med nyligt absorberet α-tocopherol, og kinetiske analyser viser, at hele poolen af ​​α-tocopherol udskiftes dagligt. Hos mennesker er den foretrukne akkumulering af α-tocopherol i kroppen afhængig af både en funktionel α-TTP og øget metabolisme og udskillelse af ikke-α-tocopheroler. Alfa-tocopherol transfer protein regulerer hele kroppens distribution og koncentrationer af vitamin E ved at kontrollere udskillelsen af ​​vitamin E fra leveren. Det er blevet set, at ekspressionen af ​​alfa-tocopherol-transferproteingenet kan induceres af oxidativt stress og hypoxi, af agonister af den nukleare receptor PPARa og RXR og ved at øge cAMP-niveauer. Dette medieres af en allerede tilstedeværende transkriptionsfaktor kaldet cAMP-responselementbindende (CREB) transkriptionsfaktor. Enkeltnukleotidpolymorfier, der almindeligvis findes hos raske mennesker, påvirker promotoraktivitet drastisk.

   Forskellige doser af vitamin E fra 400 IE til 2.000 IE er blevet brugt i kliniske forsøg. Institut for medicin, USA foreslår et anbefalet diætindtag (RDA) på 15-1.000 mg/dag (1 mg =1,5 IE; 22,5-1.500 IE/dag). Vi bruger en dosis på 400 IE i seks måneder. Der er ingen tegn på bivirkninger, hvis det tages inden for RDA, men der kan være hæmoragisk toksicitet i høje doser, især hos patienter på antikoagulantia. Derfor vil vi udelukke patienter på antikoagulantia.

   3.0 Statistiske overvejelser

   3.1 Beregning af prøvestørrelse: Den samlede estimerede prøvestørrelse for undersøgelsen er 300 patienter. Den påkrævede prøvestørrelse på 100 for hvert Hp-fænotypelag i RCT-fasen er baseret på: 5 % type I fejl; 90% effekt; antagelsen om, at vitamin E forventes at have mindst en moderat effekt, repræsenteret ved en standardiseret effektstørrelse (gennemsnitlig forskel/poolet standardfejl) på 0,5, på hver risikomarkør; to prøver t-test med samme varians; og en frafaldsprocent på 15 %. Hvis vi antager 35 % forekomst af Hp 2-2 i vores befolkning, er vi nødt til at screene 300 patienter for at rekruttere 100 Hp 2-2 fænotypepatienter.

   Antages en gennemsnitlig forskel på RHI på 0,25 enheder med tilsvarende standardafvigelse (SD) på 0,3 - hvilket giver en standardiseret effektstørrelse på 0,25/0,3 = 0,83 som minimal forskel i RHI set i en anden undersøgelse. Vi justerede ikke for flere test/sammenligninger på grund af RCT'ens pilotkarakter såvel som undersøgelsens udforskende karakter generelt.

   Prøvestørrelsen til in vitro-undersøgelsen er begrænset af begrænsede ressourcer. Ikke desto mindre indikerer simuleringsresultater baseret på en tosidet Wilcoxon Signed-Ranked test, 5 % type I fejl, en korrelation mellem par på 0,5 og 5000 Monte Carlo simuleringsprøver, at 20 par giver tilstrækkelig kraft til at detektere moderate til store standardiserede effektstørrelser (M1).

   Randomisering vil foregå elektronisk via nettet - en centraliseret adgangskodebeskyttet intranetwebside for at sikre, at patienterne randomiseres i det øjeblik, de er kvalificerede til forsøget (strengt sekventielt). En blokeret randomiseringsplan vil blive anvendt, i blokke af 10, for undersøgelsen baseret på et 1:1 tildelingsforhold. Det dedikerede password-beskyttede sted vil derefter tildele et unikt patientforsøgsnummer, som svarer til behandlingsnumrene, der er mærket i medicinæskerne. Efter randomisering vil den første dosis blive givet til patienten.

   3.2 Datahåndtering og statistiske analyser: Datahåndtering Alt relevant vil blive indsamlet ved hjælp af passende veldesignede undersøgelsesdataindsamlingsformularer ved hvert besøg og telefonopfølgningsvurdering. Alle undersøgelsesdata vil blive lagret i en undersøgelsesdatabase, som kun kan vurderes for dataindtastning og datavalideringsundersøgelsespersonale.

   Statistisk analyseplan Data om baseline demografiske og kliniske variabler samt risikomarkører vil blive opsummeret af Hp-fænotyper og overordnet for at give indsigt i potentielle sammenhænge. Binære data vil blive opsummeret ved hjælp af frekvens og proportioner. Chi-square test og Fisher eksakt test vil blive brugt til at evaluere relevante associationer (inklusive fordelene ved vitamin E), og om nødvendigt vil logistisk regression blive brugt til at karakterisere associationer, mens der justeres for potentielle konfoundere. Kontinuerlige variabler vil blive opsummeret ved hjælp af middelværdier (standardafvigelser) eller median (interval), som det skønnes passende. To eksempler på t-test eller Mann-Whitney test vil blive brugt til at evaluere relevante associationer, og generaliserede lineære modeller vil blive brugt til at karakterisere associationer, mens der justeres for potentielle konfoundere. Generaliserede lineære modeller overvejes, da de kan rumme ikke-normale (asymmetriske) data eller log-normale data (såsom laboratoriedata), hvis det er nødvendigt. Separate tests og modeller vil blive udført for hvert relevant resultat.

   Data fra in vitro undersøgelsen vil blive opsummeret på samme måde som beskrevet i det foregående afsnit, ved Hp 2-2 fænotype status og vitamin E koncentrationer. Wilcoxon Signed-Ranked test vil blive brugt til at evaluere fordelene ved vitamin E mellem Hp fænotype grupper efter koncentrationer. Mann-Whitney og Jonckheere-Terpstra test vil blive brugt til at evaluere koncentration-fordel forholdet af vitamin E ved Hp fænotype grupper. Generaliserede lineære blandede modeller vil blive anvendt til at udforske forskellige tendenser og sammenhænge, ​​mens de tager højde for (i) matchningen af ​​Hp 2-2 og ikke Hp 2-2 patienter, (ii) gentagen vurdering i en patient ved vitamin E-koncentration, (iii) justering for potentielle konfoundere, og (iv) justering for potentiel ikke-normalitet (asymmetri) af dataene ved at bruge andre passende fordelinger såsom log-normal- eller gamma-fordelinger. En overordnet analyse af data fra in vitro undersøgelse vil blive udført.

   Bland-Altman analyse vil blive brugt til at estimere og evaluere grænserne for enighed for aftalen og pålidelighedsundersøgelserne. Hvor det er relevant, vil en blandet modeltilgang blive brugt til at estimere og evaluere de relevante pålidelighedskoefficienter.

   5.0 Klinisk betydning

   Hvis der ses en sammenhæng mellem Hp 2-2 fænotype med kardiovaskulær risiko, kan denne gruppe patienter målrettes mod E-vitaminbehandling oven i statiner og anden konventionel behandling for at reducere den kardiovaskulære risiko. Fremtidig storstilet landsdækkende RCT kan planlægges for at se, om E-vitaminbehandling er med til at reducere risikoen hos denne gruppe patienter. At udføre sådanne undersøgelser i en multietnisk befolkning er bydende nødvendigt, da det giver indsigt i sammenhængen og generaliserbarheden af ​​de forventede fordele.