Związek fenotypu haptoglobiny z funkcją naczyń i odpowiedzią na suplementację witaminy E u pacjentów z cukrzycą typu 2: badanie EVAS (EVAS)

1.0 Tło i znaczenie kliniczne 1.1 Wstęp Częstość występowania cukrzycy typu 2 (DM2) szybko rośnie na całym świecie oraz w Singapurze. Główną przyczyną zwiększonej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z DM2 jest rozwój powikłań mikronaczyniowych i makronaczyniowych. Chociaż udowodniono, że ścisła kontrola glikemii zmniejsza powikłania mikronaczyniowe, nadal brakuje dowodów dotyczących powikłań makronaczyniowych. Przyspieszona miażdżyca jest główną przyczyną zwiększonej śmiertelności i zachorowalności u tych pacjentów. Ogromne znaczenie ma ocena nowych celów kontroli miażdżycy u pacjentów z DM2 oprócz konwencjonalnego leczenia. Istnieje niezaspokojona potrzeba znalezienia nowych celów lub markerów przewidujących zwiększone ryzyko u pacjentów z cukrzycą i musimy rozważyć alternatywne metody leczenia oprócz konwencjonalnych celów, aby zmniejszyć ryzyko u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka.

Pacjenci z DM2 są nie tylko bardziej narażeni na miażdżycę tętnic, ale także w większym stopniu obciążeni chorobą. Dysfunkcja śródbłonka jest uważana za cechę charakterystyczną patologicznego uszkodzenia naczyń krwionośnych. Hiperglikemia wpływa na szlaki mitochondrialne, enzymatyczne i nieenzymatyczne związane z wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS), prowadząc do zmniejszenia biodostępności tlenku azotu i dysfunkcji śródbłonka, co zwykle objawia się zmniejszonym zależnym od śródbłonka rozszerzeniem naczyń i zwiększonym stężeniem białek regulatorowych pochodzących ze śródbłonka w osoczu. Ponadto pacjenci z DM2 mają upośledzoną obronę antyoksydacyjną w postaci niskiego poziomu enzymów antyoksydacyjnych i alfa-tokoferolu (witaminy E), co może utrudniać odpowiednią kompensację wzrostu stresu oksydacyjnego. Inną rolę stresu oksydacyjnego w pośredniczeniu w rozwoju miażdżycy wykazano również w hipotezie oksydacyjnej. W tym modelu najważniejszym celem modyfikacji oksydacyjnej jest cząsteczka LDL. Utleniony LDL nie jest rozpoznawany przez receptor LDL, ale jest łatwo wychwytywany przez szlak receptora zmiatającego CD36 w makrofagach, co prowadzi do znacznej akumulacji estrów cholesterolu i tworzenia komórek piankowatych. Utleniony LDL jest prozapalny, powoduje hamowanie śródbłonkowej syntetazy NO, sprzyja skurczowi naczyń i adhezji monocytów oraz promuje agregację płytek krwi i zakrzepicę.

Fenotyp Hp i uszkodzenia tkanek oksydacyjnych

Białko haptoglobiny (Hp) jest przeciwutleniaczem ze względu na zdolność do neutralizowania aktywności oksydacyjnej hemoglobiny (Hb). U ludzi Hp charakteryzuje się polimorfizmem genetycznym z trzema strukturalnie różnymi fenotypami (Hp1-1, Hp 2-1 i Hp 2-2, które wynikają z ekspresji dwóch różnych alleli (Hp 1 i Hp 2) genu haptoglobiny zlokalizowanego na chromosom 16q22. Produkt białkowy allelu Hp2 jest gorszym przeciwutleniaczem w porównaniu z produktem allelu Hp1. Hp 1-1 jest małą cząsteczką (86 kDa) o dobrze określonej strukturze, podczas gdy Hp 2-1 charakteryzuje się heteropolimerami (86-300 kDa), a Hp 2-2 tworzy duże kompleksy makrocząsteczkowe (170-1000 kDa).

Funkcją Hp jest wiązanie wolnej Hb uwalnianej z krwinek czerwonych, która jest uwalniana do krwi podczas naturalnego obrotu krwinek czerwonych. Wolna Hb jest zdolna do powodowania znacznych uszkodzeń tkanek oksydacyjnych w wyniku obecności żelaza hemowego. Jednak za każdym razem, gdy Hb jest uwalniana do krążenia, natychmiast wiąże się z Hp z niezwykle wysokim powinowactwem, tworząc kompleks Hp-Hb. To wiązanie służy do hamowania potencjału oksydacyjnego Hb poprzez zapobieganie uwalnianiu żelaza hemowego z Hb. Hp normalnie występuje we krwi w ponad 400-krotnym nadmiarze molowym w stosunku do wolnej Hb i dlatego Hp jest w stanie związać całą Hb, która jest uwalniana podczas normalnego obrotu krwinek czerwonych. Gdy Hb zwiąże się z Hp, jest szybko usuwana z krwioobiegu przez receptor CD163 wychwytujący, który ulega ekspresji na monocytach/makrofagach, jednak tworzenie i klirens kompleksów Hp-Hb jest upośledzony w fenotypach Hp 2-2.

Żelazo pochodzące z Hb może katalizować szereg reakcji utleniania, które mogą być hamowane przez Hp.

1. Żelazo hemowe (Fe2+) może reagować z nadtlenkiem wodoru, dając Hb żelazowe (Fe3+) i wysoce reaktywne rodniki hydroksylowe. Pobierając atom wodoru z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, rodniki hydroksylowe mogą inicjować proces peroksydacji lipidów.
2. Hb żelazowy (Fe2+) może również reagować z nadtlenkiem wodoru, tworząc żelazowęglan (Fe4+), wysoce niestabilną cząsteczkę, która łatwo reaguje z drugą cząsteczką nadtlenku wodoru, dając Hb żelazowy (Fe3+) i anion ponadtlenkowy. Szkodliwe działanie anionu ponadtlenkowego jest dwojakie: redukcja żelaza (Fe3+) w Hb do żelaza (Fe2+), co pozwala na produkcję dodatkowego rodnika hydroksylowego, jak opisano w reakcji 1, oraz dysmutacja anionu ponadtlenkowego w celu wytworzenia nadtlenku wodoru , ponownie promując produkcję ROS.

3. Żelaza Hb (zawierająca Fe3+), znana również jako methemoglobina, może spontanicznie przenosić swoje ugrupowanie hemu, powodując wejście hemu do różnych środowisk lipofilowych, takich jak LDL lub błony komórkowe. Po włączeniu do nowego środowiska lipidowego żelazo hemowe może ulegać reakcjom z nadtlenkiem wodoru, jak opisano powyżej, lub z sąsiednimi nadtlenkami lipidów, tworząc kaskadę wolnych rodników i prowadząc do intensywnego utleniania lipidów.

   Jako część kompleksu Hp-Hb, Hp stabilizuje hem w kieszeni hemowej Hb i zapobiega powodowaniu przez Hb uszkodzeń oksydacyjnych. Jednak stopień, w jakim Hp neutralizuje aktywność redoks żelaza hemowego, różni się w zależności od typu Hp. Zostało to wykazane w wielu układach zarówno in vitro, jak i in vivo. Na przykład badania z użyciem kwasu linolenowego wykazały, że Hp 1-1 zapobiegał utlenianiu (tworzenie dienu), co zmierzono przez wzrost absorbancji przy 232 nm w większym stopniu niż Hp 2-2. W innym badaniu zbadano utlenianie LDL w wyniku przeniesienia hemu z Hb na LDL. Przenoszenie hemu mierzono przez wygaszanie sygnału fluorescencji emitowanego przez dansylowany LDL. Stwierdzono, że Hp 1-1 skuteczniej zapobiegał przenoszeniu hemu z Hb w porównaniu z Hp 2-2.

   Fenotypy Hp i badania ryzyka sercowo-naczyniowego wykazały, że kompleksy Hp 2-2 Hb są również usuwane mniej skutecznie niż kompleksy inne niż Hp 2-2 Hb. U pacjentów z DM2 zjawisko to jest bardziej wyraźne ze względu na obniżenie poziomu CD163, szczególnie u osób z Hp 2-2. Upośledzenie przeciwzapalnej sygnalizacji makrofagów poprzez oś CD163/pAkt/IL-10 obserwuje się również u pacjentów z Hp 2-2.

   Niedobór klirensu Hp-Hb u osobników z Hp 2-2 DM2 skutkuje zwiększonym wiązaniem Hp-Hb z Apo A1 na lipoproteinie o dużej gęstości (HDL-C), tym samym wiążąc ugrupowanie prooksydacyjne hemu z HDL. To powoduje, że ma niedobór zdolności do odwracania przenoszenia cholesterolu z makrofagów.

   Białko Hp 2-2 jest mniej skuteczne w blokowaniu przenoszenia hemu z Hb w porównaniu z Hp 1-1. Ponadto wzrost transferu hemu, gdy Hb jest glikozylowana, może stanowić mechanistyczne wyjaśnienie wzrostu chorób sercowo-naczyniowych obserwowanego w Hp 2-2 DM2.

   Stąd fenotyp Hp 2-2 jest związany ze zmniejszoną zdolnością wiązania się z Hb, zmniejszonym klirensem kompleksów Hp 2-2 Hb, upośledzeniem przeciwzapalnego szlaku sygnałowego, zwiększonym utlenianiem LDL, sprawia, że ​​cholesterol HDL jest nieefektywny i mniej skuteczny w blokowaniu transferu hemu od Hb do Hp 1-1, wszystkie prowadzą do wyższego ryzyka sercowo-naczyniowego. U pacjentów z cukrzycą, u których niektóre z tych szlaków są również zaburzone, efekt synergii hiperglikemii i fenotypu haptoglobiny jest nasilony, co prowadzi do zwiększonego ryzyka.

   W badaniach podłużnych przeprowadzonych w innych populacjach zaobserwowano, że genotyp Hp 2-2 wiąże się z 2-5-krotnym wzrostem ryzyka incydentów sercowo-naczyniowych u osób z cukrzycą. W szczególności w badaniu silnego serca iloraz szans wystąpienia CVD w DM z fenotypem Hp 2-2 był 2-5 razy większy niż w DM z fenotypem Hp 2-1 (p=0,002). W badaniu Munich Stent przez rok po wszczepieniu stentu obserwowano kolejne serie 935 leczonych osób z cukrzycą pod kątem poważnych niepożądanych zdarzeń sercowych. W tym badaniu fenotyp haptoglobiny 2-2 okazał się niezależnym predyktorem poważnych niepożądanych zdarzeń sercowych. Ponadto zaobserwowano, że witamina E zapewnia znaczne korzyści sercowo-naczyniowe pacjentom z Hp 2-2 DM w jednej populacji (badanie Israel-ICARE) oraz analiza post-hoc badania WHS (badanie zdrowia kobiet) i HOPE w celu sprawdzenia, czy witamina E Suplementacja E w podgrupie pacjentów z fenotypem haptoglobiny 2-2 wpływającym na śmiertelność wykazała nieistotne zmniejszenie śmiertelności całkowitej. Nie zostało to powszechnie przyjęte, ponieważ potrzebne są większe badania i na wielu populacjach, aby uzasadnić związek i korzyści.

   Hp Fenotyp i pochodzenie etniczne

   W lokalnym badaniu przeprowadzonym w Singapurze zaobserwowano, że częstotliwość genów Hp różni się w różnych grupach etnicznych w następujący sposób: Chińczycy Hp1:0,330;Hp2:0,670;Hp0: 0,029; Malajowie: HP1: 0,298; HP2: 0,702 ;Hp0:0,004; Indianie Hp1: 0,167; Hp2: 0,833; Hp0: 0,009. Zaobserwowano, że rozkład częstotliwości Hp w naszej populacji znajduje się w równowadze Hardy'ego-Weinberga, stąd oczekiwana częstość występowania Hp 2-2 wynosi około 30-40%. Fenotypy Hp zostaną określone za pomocą analizy TaqMan w Laboratorium Badawczym TTSH.

   1.2 Genotypy haptoglobiny i funkcja śródbłonka

   Coraz więcej uwagi poświęca się dysfunkcji śródbłonka jako potencjalnemu czynnikowi przyczyniającemu się do patogenezy choroby naczyniowej w DM. W DM2 naturalna delikatna równowaga w uwalnianiu przez śródbłonek czynników kurczących i rozkurczających jest zmieniona, co przyczynia się do dalszego uszkodzenia naczyń i narządów końcowych. Postuluje się, że upośledzona funkcja śródbłonka zapewnia ostateczną wspólną ścieżkę, przez którą wiele czynników ryzyka wywiera szkodliwy wpływ na zdrowie układu sercowo-naczyniowego i została uznana za potężny zastępczy marker ryzyka sercowo-naczyniowego, a jedno badanie wykazało nawet lepszą przewidywalność niż wskaźnik ryzyka Framingham. Urządzenie EndoPAT 2000 zostanie użyte, ponieważ zostało ustalone do oceny funkcji śródbłonka w sposób nieinwazyjny.

   Nie przeprowadzono bezpośrednich badań dotyczących związku genotypów Hp z funkcją śródbłonka, w jednym badaniu pilotażowym, w którym funkcję śródbłonka oceniano za pomocą przekrwienia reaktywnego po niedokrwieniu i pletyzmografii tensometrycznej i wyrażono jako maksymalny przepływ po okresie niedokrwienia, zaobserwowano że pacjenci z Hp 2-2 z cukrzycą mieli gorszą funkcję śródbłonka w porównaniu z pacjentami bez Hp 2-2 (450 ± 50 w porównaniu z 600 ± 40).

   1.3 Genotypy haptoglobiny i CIMT (grubość błony środkowej tętnicy szyjnej)

   W badaniu Diabetes Heart analizy genetyczne genotypów Hp wykazały związek między genotypem Hp 2-2 a grubością błony środkowej tętnicy szyjnej (CIMT). Pomiary te zostaną wykonane w pozycji leżącej, z głową wyciągniętą i lekko zwróconą w kierunku przeciwnym do badanej tętnicy szyjnej, zgodnie z zaleceniami konsensusu Mannheim CIMT. Dwóch badaczy oszacowało CIMT u 23 osób i sporządzono wykres Blanda-Altmana a granice zgodności między użytkownikami mieściły się w zakresie od -0,1 do +0,1.

   1.4 Genotypy haptoglobiny a sztywność tętnicy aortalnej

   Chociaż nie przeprowadzono bezpośrednich badań porównujących genotypy Hp i sztywność tętnicy aorty, przeprowadzono jedno badanie, w którym oceniano elastyczność tętnic dużych i małych tętnic za pomocą metody analizy konturu fali tętna. Wskaźnik elastyczności dużych tętnic był niższy u pacjentów z Hp 2-2 w porównaniu z Hp 1-1 (8,4 ±2,3 ml/mmHg w porównaniu z 12,6 ±4,1 ml/mmHg x 100; p

   Zwiększoną sztywność naczyń obserwowano we wczesnym okresie cukrzycy typu 2 przy użyciu urządzenia sphygmocor. Jest prawdopodobne, że ta sztywność jest związana raczej z dysfunkcją śródbłonka niż strukturalnymi zmianami naczyniowymi – to z kolei sugeruje, że jest odwracalna. Zaobserwowano również, że prędkość fali tętna w aorcie (PWV), miara rozciągliwości aorty, pozwala przewidywać śmiertelność u pacjentów z cukrzycą niezależnie od znanych czynników zakłócających. Zastosowane zostanie urządzenie SphygmoCor Xcel do oceny sztywności tętnicy aortalnej na podstawie prędkości fali tętna od tętnicy szyjnej do kości udowej oraz ciśnienia centralnego w aorcie. Badacze oszacują prędkość fali tętna u 20 osób, aby ustalić granice zgodności za pomocą wykresu Blanda-Altmana przed rozpoczęciem badania.

   1.5 Genotypy haptoglobiny i markery naczyniowe

   Cząsteczka adhezji komórek naczyniowych-1 (VCAM-1) i cząsteczka adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1) to białka ulegające ekspresji na powierzchni aktywowanych komórek śródbłonka (EC) i wyrażane we wczesnej miażdżycy tętnic. Markery te zostały ocenione i uznane za dobre markery dysfunkcji śródbłonka, ponieważ część białka jest wydalana z krążeniem i może być wykryta w osoczu krwi obwodowej.

   1.6 Genotypy haptoglobiny i fenotypowanie lipidów osocza

   Fenotyp Hp 2-2 został powiązany z wyższymi stężeniami utlenionego LDL, który jest głównie zaangażowany w miażdżycę tętnic. Wiadomo również, że w tej grupie pacjentów stężenie Apo-A1 HDL jest wyższe. Fenotyp Hp 2-2 może być również związany z wyższymi stężeniami Lp(a), narażając tych pacjentów na większe ryzyko sercowo-naczyniowe. Przeprowadzone zostanie szczegółowe fenotypowanie lipidów osocza przy użyciu proteomiki w celu poszukiwania nowych powiązań.

   1.7 Genotypy haptoglobiny a stres oksydacyjny

   Wiadomo, że genotyp Hp 2-2 powoduje większy stres oksydacyjny w śródbłonku. Całkowity potencjał oksydacyjny zostanie obliczony jako INDEKS Oksydacyjny. W celu obliczenia tego wskaźnika zostaną przeprowadzone dwa testy w następujący sposób. Wskaźnik ten został ustalony jako dobre oszacowanie ogólnego stresu oksydacyjnego.

   1. Test d-ROM: Ten test zostanie przeprowadzony na próbkach surowicy przy użyciu zautomatyzowanej metody d-ROM. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Wynik stresu oksydacyjnego jako połączona miara odpowiedników prooksydacyjnych i przeciwutleniających u pacjentów z chorobą wieńcową. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. FRAP (zdolność osocza do redukcji żelaza – miara zdolności osocza do zapobiegania uszkodzeniom naczyń) i test d-ROM (pochodne metabolitów reaktywnego tlenu) zostaną wykorzystane do obliczenia wyniku stresu oksydacyjnego.

   Zmierzone zostaną również inne markery stresu oksydacyjnego, takie jak glioksal, metyloglioksal, asymetryczna dimetyloarginina i homoarginina.

   1.8 Genotypy haptoglobiny i indeks tętniczo-żylny siatkówki

   Obecność nieprawidłowości mikrokrążenia siatkówki, zwłaszcza zwężenia tętnic i poszerzenia żył, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem sercowo-naczyniowym i jest związana z dysfunkcją śródbłonka i stanem zapalnym. Obecnie nie ma badań dotyczących związku między genotypami Hp a wskaźnikiem tętniczo-żylnym siatkówki (AV). . Przed badaniem zostaną zakroplone krople do oczu w celu rozszerzenia źrenic do badania dna oka i nawilżenia rogówki. Obrazowanie siatkówki zostanie wykonane dla pacjentów w klinice okulistycznej. Jeśli pacjenci nie chcą uczestniczyć w badaniu obrazowym siatkówki, mogą zrezygnować z badania obrazowego siatkówki.

   2.0 Witamina E, fenotyp haptoglobiny i redukcja ryzyka sercowo-naczyniowego

   Podczas gdy różnice funkcjonalne między allelicznymi produktami białkowymi Hp1 i Hp2, szczególnie w DM, mogą wyjaśniać różnice w podatności na powikłania u osób z Hp 2-2 i osób bez Hp 2-2, głównym powodem wyjątkowych korzyści ze stosowania witaminy E jest to, że aktywna redoks Hb jest związany z HDL tylko u osób z Hp 2-2 DM. U pacjentów z DM zmniejszone kompleksy Hp-Hb powodują zwiększone wiązanie Hp-Hb z Apo-A1 na lipoproteinie o dużej gęstości (HDL), tym samym wiążąc prooksydacyjne ugrupowanie hemu z HDL. HDL u osobników z Hp 2-2 DM ma niedobór zdolności do stymulowania odwrotnego transferu cholesterolu z makrofagów. Poza tym fenotyp Hp 2-2 jest związany ze zwiększonym stresem oksydacyjnym z powodu niedostatecznego klirensu wolnych rodników i zwiększonej peroksydacji LDL.

   Witamina E jest silnym przeciwutleniaczem o właściwościach przeciwzapalnych. Znacząco łagodzi stan stresu oksydacyjnego, zarówno dzięki silnym właściwościom wychwytywania wolnych rodników, jak i poprzez bezpośrednią i silną interakcję z enzymami antyoksydacyjnymi. Wykazano, że suplementacja witaminy E u ludzi i na modelach zwierzęcych zmniejsza peroksydację lipidów, produkcję nadtlenków i zmniejsza ekspresję receptorów zmiataczy (SR-A i CD36), które są szczególnie ważne w tworzeniu komórek piankowatych. Chociaż nie udowodniono, aby witamina E była użyteczna w zmniejszaniu ryzyka sercowo-naczyniowego w populacji ogólnej, okazała się przydatna u pacjentów z fenotypem Hp 2-2 z cukrzycą, przy czym obie te choroby znacznie zwiększają stres oksydacyjny w badaniach przeprowadzonych w jednej populacji.

   Były tylko trzy interwencyjne badania z randomizacją (RCT), w których jedynym przeciwutleniaczem, jaki otrzymywali uczestnicy DM, była witamina E iw których określono typ Hp uczestników badania. Badanie ICARE było jedynym RCT, którego celem była ocena witaminy E u pacjentów z cukrzycą, u których prospektywnie zebrano genotyp Hp. W tym badaniu 1434 osób z cukrzycą > lub = 55 lat z fenotypem Hp 2-2 losowo przydzielono do grupy otrzymującej witaminę E (400 IU/dzień/placebo). Pierwotny złożony wynik był znacznie zmniejszony u osób otrzymujących witaminę E (2,2%) w porównaniu z placebo (4,7%, p=0,001) po 18 miesiącach od rozpoczęcia badania, kiedy zostało ono zakończone. Ponadto próbki krwi od podgrupy pacjentów rekrutowanych do badań WHS i HOPE analizowano pod kątem polimorfizmu Hp, a wyniki oceniano ponownie zgodnie z typem Hp pacjenta. We wszystkich tych badaniach wyższe ryzyko incydentów sercowo-naczyniowych obserwowano u osób z Hp 2-2 iw tej grupie obserwowano korzyści z suplementacji witaminy E.

   2.1 Uzasadnienie dawki i czasu przyjmowania witaminy E (alfa-tokoferolu).

   Będziemy stosować witaminę E 400 IU dziennie i dopasowane placebo. Zlecimy firmie Beacons przygotowanie kapsułek witaminy E (400 IU) oraz pasujących do nich kapsułek placebo. Preparatem witaminy E będzie naturalny tokoferol występujący w konfiguracji RRR. Będziemy podawać witaminę E w dawce 400 IU przez 6 miesięcy, ponieważ większość badań wykorzystujących zastępcze markery ryzyka sercowo-naczyniowego wykazała poprawę w ciągu 6 miesięcy po suplementacji. Co więcej, we wspomnianym powyżej badaniu ICARE zaobserwowano poprawę wyników sercowo-naczyniowych po 18 miesiącach, co sugeruje, że 6 miesięcy powinno być odpowiednim okresem, aby zaobserwować poprawę zastępczych wskaźników ryzyka sercowo-naczyniowego.

   Osiem form witaminy E dzieli się na dwie grupy; cztery to tokoferole, a cztery to tokotrienole. Są one identyfikowane przez przedrostki alfa- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) i delta- (δ-). alfa-tokoferol jest najbardziej rozpowszechnioną formą w przyrodzie, o której wiadomo, że ma najwyższą aktywność biologiczną w oparciu o testy resekcji płodu i odwraca objawy niedoboru witaminy E u ludzi. Naturalne tokoferole występują tylko w konfiguracji RRR. Forma syntetyczna zawiera osiem różnych stereoizomerów i nosi nazwę „all-rac”-α-tokoferolu.

   Witamina E w swojej naturalnej postaci występuje w olejach roślinnych (z kiełków pszenicy, słonecznika, krokosza barwierskiego, kukurydzianego i sojowego), orzechach (migdały, orzeszki ziemne i orzechy laskowe), nasionach (nasiona słonecznika), zielonych warzywach liściastych (szpinak i brokuły) oraz we wzbogaconych płatki śniadaniowe, soki owocowe, margaryna i pasty do smarowania. Instytut Medycyny zaleca spożycie dla osób fizycznych wynosi około 15 mg / dzień. Najwyższy bezpieczny poziom suplementacji witaminy E dla dorosłych wynosi 1500 IU/dzień dla naturalnych form witaminy E i 1000 IU/dzień dla postaci syntetycznej. Popularne dostępne suplementy witaminy E obejmują D-alfa tokoferol, który pochodzi z naturalnych olejków. Dostępne w handlu suplementy witaminy E zwykle zawierają tylko alfa-tokoferol dostarczany w postaci niezestryfikowanej lub jako ester octanu, bursztynianu lub nikotynianu. U ludzi wolny i zestryfikowany alfa-tokoferol mają taką samą biodostępność. Suplementy mogą zawierać naturalny alfa-tokoferol RRR lub syntetyczny (all-rac). Aktywność biologiczna naturalnego alfa-tokoferolu RRR jest wyższa niż syntetycznego all-rac-alfa-tokoferolu i innych naturalnych form witaminy E.

   Zarówno stres oksydacyjny, jak i indywidualny skład genetyczny przyczyniają się do homeostazy witaminy E u ludzi, co może być odpowiedzialne za zmienne efekty kliniczne obserwowane w poprawie zmiennych klinicznych w badaniach klinicznych. Witamina E jest wchłaniana w jelicie, dostaje się do krwioobiegu przez układ limfatyczny, gdzie wchłaniana wraz z lipidami jest pakowana w chylomikrony i transportowana do wątroby. Po przejściu przez wątrobę tylko alfa-tokoferol pojawia się w osoczu preferencyjnie, a większość innych form witaminy E jest preferencyjnie metabolizowana i albo wydzielana z żółcią, albo nie jest wchłaniana i wydalana z kałem. W wątrobie wątrobowe białko przenoszące alfa-tokoferol (α-TTP) specyficznie rozdziela formę α ze stereoizomerami 2R. Wbudowywanie RRR-α-tokoferolu do osocza jest procesem wysycalnym. Stężenie RRR-α-tokoferolu w osoczu przestaje rosnąć przy około 80 μM pomimo zwiększania dawek suplementacji witaminy E do 1320 mg all-rac-α-tokoferolu dziennie. Jest to prawdopodobnie wtórne do szybkiego zastąpienia krążącego nowo wchłoniętym α-tokoferolem, a analizy kinetyczne pokazują, że cała pula α-tokoferolu jest wymieniana codziennie. U ludzi preferencyjna akumulacja α-tokoferolu w organizmie zależy zarówno od funkcjonalnego α-TTP, jak i zwiększonego metabolizmu i wydalania nie-α-tokoferoli. Białko przenoszące alfa-tokoferol reguluje dystrybucję i stężenie witaminy E w całym organizmie, kontrolując wydzielanie witaminy E z wątroby. Zaobserwowano, że ekspresja genu białka przenoszącego alfa-tokoferol może być indukowana przez stres oksydacyjny i niedotlenienie, przez agonistów receptora jądrowego PPARα i RXR oraz przez zwiększenie poziomów cAMP. Pośredniczy w tym już obecny czynnik transkrypcyjny zwany czynnikiem transkrypcyjnym wiążącym element odpowiedzi cAMP (CREB). Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, powszechnie spotykane u zdrowych ludzi, drastycznie wpływają na aktywność promotora.

   W badaniach klinicznych stosowano różne dawki witaminy E, od 400 IU do 2000 IU. Instytut medycyny w USA sugeruje zalecane spożycie w diecie (RDA) na poziomie 15-1000 mg/dzień (1 mg = 1,5 IU; 22,5-1500 IU/dzień). Stosujemy dawkę 400 IU przez pół roku. Nie ma dowodów na działania niepożądane, jeśli jest przyjmowany w ramach RDA, jednak w dużych dawkach może wystąpić toksyczność krwotoczna, zwłaszcza u pacjentów przyjmujących leki przeciwzakrzepowe. Dlatego będziemy wykluczać pacjentów przyjmujących antykoagulanty.

   3.0 Rozważania statystyczne

   3.1 Obliczenie wielkości próby: Ogólna szacunkowa wielkość próby do badania wynosi 300 pacjentów. Wymagana wielkość próby wynosząca 100 dla każdej warstwy fenotypu Hp fazy RCT jest oparta na: 5% błędzie typu I; 90% mocy; założenie, że oczekuje się, że witamina E będzie miała co najmniej umiarkowany wpływ, reprezentowany przez standaryzowaną wielkość efektu (średnia różnica/zbiorczy błąd standardowy) wynoszący 0,5, na każdy znacznik ryzyka; test t dla dwóch próbek z równą wariancją; i 15% wskaźnik rezygnacji. Zakładając 35% występowanie Hp 2-2 w naszej populacji, musimy przebadać 300 pacjentów, aby zrekrutować 100 pacjentów z fenotypem Hp 2-2.

   Zakładając średnią różnicę w RHI wynoszącą 0,25 jednostki z odpowiednim odchyleniem standardowym (SD) wynoszącym 0,3 – co daje standaryzowaną wielkość efektu 0,25/0,3 = 0,83 jako minimalna różnica w RHI obserwowana w innym badaniu. Nie dostosowaliśmy się do wielu testów/porównań ze względu na pilotażowy charakter RCT, jak również ogólnie na eksploracyjny charakter badania.

   Wielkość próby do badania in vitro jest ograniczona ograniczonymi zasobami. Niemniej jednak wyniki symulacji oparte na dwustronnym teście Wilcoxona Signed-Ranked, 5% błąd typu I, korelacja między parami 0,5 i 5000 próbek symulacji Monte Carlo wskazują, że 20 par zapewnia odpowiednią moc do wykrywania średnich i dużych znormalizowanych wielkości efektów (M1).

   Randomizacja zostanie przeprowadzona elektronicznie za pośrednictwem sieci — scentralizowanej, chronionej hasłem witryny intranetowej, aby zapewnić randomizację pacjentów w momencie, gdy zakwalifikują się do badania (ściśle sekwencyjnie). Zablokowany harmonogram randomizacji zostanie zastosowany, w blokach po 10, dla badania opartego na stosunku alokacji 1:1. Dedykowana witryna chroniona hasłem przydzieli następnie unikalny numer badania pacjenta, który będzie odpowiadał numerom zabiegów podanym na opakowaniach leków. Po randomizacji pacjentowi zostanie podana pierwsza dawka.

   3.2 Przetwarzanie danych i analizy statystyczne: Przetwarzanie danych Wszystkie istotne informacje będą gromadzone przy użyciu odpowiednich, dobrze zaprojektowanych formularzy gromadzenia danych badawczych podczas każdej wizyty i telefonicznej oceny uzupełniającej. Wszystkie dane z badań będą przechowywane w bazie danych badań, którą można oceniać wyłącznie dla personelu zajmującego się wprowadzaniem danych i walidacją danych.

   Plan analizy statystycznej Dane dotyczące wyjściowych zmiennych demograficznych i klinicznych, a także markerów ryzyka zostaną podsumowane według fenotypów Hp i ogólnie, aby zapewnić wgląd w potencjalne powiązania. Dane binarne zostaną podsumowane przy użyciu częstotliwości i proporcji. Test chi-kwadrat i dokładny test Fishera zostaną użyte do oceny odpowiednich powiązań (w tym korzyści witaminy E), a jeśli to konieczne, regresja logistyczna zostanie wykorzystana do scharakteryzowania powiązań z uwzględnieniem potencjalnych czynników zakłócających. Zmienne ciągłe zostaną podsumowane za pomocą średnich (odchylenia standardowe) lub mediany (zakres), jeśli uzna się to za stosowne. Test t dla dwóch próbek lub test Manna-Whitneya zostaną użyte do oceny odpowiednich powiązań, a uogólnione modele liniowe zostaną wykorzystane do scharakteryzowania powiązań z uwzględnieniem potencjalnych czynników zakłócających. Rozważane są uogólnione modele liniowe, ponieważ w razie potrzeby mogą uwzględniać dane odbiegające od normalnych (asymetryczne) lub dane logarytmiczno-normalne (takie jak dane laboratoryjne). Dla każdego istotnego wyniku zostaną przeprowadzone oddzielne testy i modele.

   Dane z badania in vitro zostaną podsumowane podobnie jak opisano w poprzednim akapicie, według statusu fenotypu Hp 2-2 i stężeń witaminy E. Test Wilcoxon Signed-Ranked zostanie wykorzystany do oceny korzyści witaminy E między grupami fenotypowymi Hp według stężeń. Testy Manna-Whitneya i Jonckheere-Terpstry zostaną użyte do oceny stosunku stężenia do korzyści witaminy E według grup fenotypowych Hp. Uogólnione liniowe modele mieszane zostaną wykorzystane do zbadania różnych trendów i powiązań przy uwzględnieniu (i) dopasowania pacjentów z Hp 2-2 i bez Hp 2-2, (ii) powtórnej oceny u pacjenta na podstawie stężenia witaminy E, (iii) dostosowanie pod kątem potencjalnych czynników zakłócających oraz (iv) dostosowanie pod kątem potencjalnej nienormalności (asymetrii) danych za pomocą innych odpowiednich rozkładów, takich jak rozkłady logarytmiczno-normalne lub rozkłady gamma. Przeprowadzona zostanie ogólna analiza danych z badania in vitro.

   Analiza Blanda-Altmana zostanie wykorzystana do oszacowania i oceny granic zgodności dla badań zgodności i niezawodności. W stosownych przypadkach do oszacowania i oceny odpowiednich współczynników niezawodności zastosowane zostanie podejście oparte na modelach mieszanych.

   5.0 Znaczenie kliniczne

   Jeśli obserwuje się związek między fenotypem Hp 2-2 a ryzykiem sercowo-naczyniowym, tę grupę pacjentów można skierować na leczenie witaminą E oprócz statyn i innego konwencjonalnego leczenia w celu zmniejszenia ryzyka sercowo-naczyniowego. Można zaplanować przyszłe ogólnokrajowe RCT na dużą skalę, aby sprawdzić, czy leczenie witaminą E pomaga zmniejszyć ryzyko w tej grupie pacjentów. Przeprowadzenie takich badań w populacji wieloetnicznej jest konieczne, ponieważ zapewnia wgląd w spójność i możliwość uogólnienia oczekiwanych korzyści.