Relazione tra fenotipo di aptoglobina e funzione vascolare e risposta alla supplementazione di vitamina E in pazienti con diabete mellito di tipo 2: lo studio EVAS (EVAS)

1.0 Contesto e significato clinico 1.1 Introduzione L'incidenza del diabete mellito di tipo 2 (DM2) sta crescendo rapidamente a livello globale ea Singapore. La causa principale dell'aumento della morbilità e della mortalità nei pazienti con DM2 è lo sviluppo di complicanze microvascolari e macrovascolari. Sebbene sia stato dimostrato che un rigoroso controllo glicemico riduca le complicanze microvascolari, mancano ancora prove per quanto riguarda le complicanze macrovascolari. L'aterosclerosi accelerata è la principale causa di aumento della mortalità e della morbilità in questi pazienti. È di fondamentale importanza valutare nuovi bersagli per controllare l'aterosclerosi nei pazienti con DM2 in aggiunta al trattamento convenzionale. C'è un'esigenza insoddisfatta di trovare nuovi obiettivi o marcatori che prevedano un aumento del rischio nei pazienti con diabete mellito e dobbiamo considerare trattamenti alternativi oltre agli obiettivi convenzionali per ridurre il rischio in questi pazienti del gruppo ad alto rischio.

I pazienti con DM2 non sono solo a maggior rischio di aterosclerosi, ma portano anche un maggior carico di malattia. La disfunzione endoteliale è considerata il segno distintivo dell'insulto patologico inflitto ai vasi sanguigni. L'iperglicemia colpisce le vie mitocondriali, enzimatiche e non enzimatiche associate alla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), portando a una ridotta biodisponibilità dell'ossido nitrico e disfunzione endoteliale, comunemente dimostrata dalla ridotta vasodilatazione endotelio-dipendente e dall'aumento dei livelli plasmatici delle proteine ​​regolatrici derivate dall'endotelio. Inoltre, i pazienti con DM2 hanno difese antiossidanti compromesse sotto forma di bassi livelli degli enzimi antiossidanti e dell'alfa-tocoferolo (vitamina E), che possono impedire un'adeguata compensazione per l'aumento dello stress ossidativo. Un altro ruolo dello stress ossidativo nel mediare lo sviluppo dell'aterosclerosi è stato dimostrato anche nell'ipotesi ossidativa. In questo modello l'obiettivo più importante per la modificazione ossidativa è la molecola LDL. Le LDL ossidate non sono riconosciute dal recettore LDL, ma sono prontamente assorbite dalla via del recettore scavenger CD36 nei macrofagi, portando a un notevole accumulo di esteri del colesterolo e alla formazione di cellule schiumose. Le LDL ossidate sono proinfiammatorie, provocano l'inibizione della NO sintetasi endoteliale, promuovono la vasocostrizione e l'adesione dei monociti e promuovono l'aggregazione piastrinica e la trombosi.

Fenotipo Hp e danno tissutale ossidativo

La proteina aptoglobina (Hp) è un antiossidante grazie alla sua capacità di neutralizzare l'attività ossidativa dell'emoglobina (Hb). Nell'uomo, Hp è caratterizzato da un polimorfismo genetico con tre fenotipi strutturalmente diversi (Hp1-1, Hp 2-1 e Hp 2-2 che derivano dall'espressione di due diversi alleli (Hp 1 e Hp 2) del gene dell'aptoglobina situato sulla cromosoma 16q22. Il prodotto proteico dell'allele Hp2 è un antiossidante inferiore rispetto al prodotto dell'allele Hp1. Hp 1-1 è una piccola molecola (86kDa) di struttura ben definita, mentre Hp 2-1 è caratterizzata da eteropolimeri (86-300 kDA) e Hp 2-2 forma grandi complessi macromolecolari (170-1.000 kDa).

La funzione di Hp è quella di legare l'Hb libero rilasciato dai globuli rossi, che viene rilasciato nel sangue durante il ricambio naturale dei globuli rossi. L'Hb libera è in grado di causare notevoli danni ossidativi ai tessuti a causa del suo ferro eme. Tuttavia, ogni volta che l'Hb viene rilasciato nella circolazione, si lega immediatamente all'Hp con un'affinità estremamente elevata per formare un complesso Hp-Hb. Questo legame serve ad inibire il potenziale ossidativo dell'Hb prevenendo il rilascio di ferro eme dall'Hb. L'Hp si trova normalmente nel sangue in un eccesso molare superiore a 400 volte rispetto all'Hb libera e quindi l'Hp è in grado di legare tutta l'Hb che viene rilasciata durante il normale turnover dei globuli rossi. Una volta che l'Hb si è legato all'Hp, viene rapidamente eliminato dal flusso sanguigno tramite il recettore scavenger CD163 espresso su monociti/macrofagi, tuttavia, la formazione e l'eliminazione dei complessi Hp-Hb sono compromesse nei fenotipi Hp 2-2.

Il ferro derivato da Hb può catalizzare una serie di reazioni ossidative che possono essere inibite da Hp.

1. Il ferro eme ferroso (Fe2+) può reagire con il perossido di idrogeno per produrre Hb ferrico (Fe3+) e le specie di radicali idrossilici altamente reattivi. Estraendo un atomo di idrogeno dagli acidi grassi polinsaturi, i radicali idrossilici possono avviare il processo di perossidazione lipidica.
2. L'Hb ferroso (Fe2+) può anche reagire con il perossido di idrogeno per produrre l'Hb ferril (Fe4+), una molecola altamente instabile che reagisce prontamente con una seconda molecola di perossido di idrogeno per produrre l'Hb ferrico (Fe3+) e l'anione superossido. Gli effetti dannosi dell'anione superossido sono duplici: riduzione del ferro ferrico (Fe3+) in Hb a ferro ferroso (Fe2+), consentendo la produzione di radicali idrossilici aggiuntivi come descritto nella reazione 1, e dismutazione dell'anione superossido per produrre perossido di idrogeno , promuovendo nuovamente la produzione di ROS.

3. L'Hb ferrica (contenente Fe3+), nota anche come metaemoglobina, può trasferire spontaneamente la sua frazione eme con conseguente ingresso dell'eme in diversi ambienti lipofili come LDL o membrane cellulari. Una volta intercalato nel suo nuovo ambiente lipidico, il ferro eme può subire reazioni con il perossido di idrogeno come descritto sopra o con i perossidi lipidici adiacenti generando una cascata di radicali liberi e portando a un'estesa ossidazione dei lipidi.

   Come parte del complesso Hp-Hb, Hp stabilizza l'eme nella tasca dell'eme dell'Hb e impedisce all'Hb di causare danno ossidativo. Tuttavia, il grado in cui Hp neutralizza l'attività redox del ferro eme differisce tra i tipi di Hp. Ciò è stato dimostrato in numerosi sistemi sia in vitro che in vivo. Ad esempio, gli studi che utilizzano l'acido linolenico hanno mostrato che Hp 1-1 ha impedito l'ossidazione (formazione di diene) come misurato da un aumento dell'assorbanza a 232 nm in misura maggiore rispetto a Hp 2-2 . Un altro studio ha esaminato l'ossidazione delle LDL dovuta al trasferimento dell'eme da Hb a LDL. Il trasferimento dell'eme è stato misurato spegnendo il segnale di fluorescenza emesso dalle LDL dansilate. È stato riscontrato che Hp 1-1 era superiore nel prevenire il trasferimento dell'eme da Hb rispetto a Hp 2-2.

   Studi sui fenotipi Hp e sul rischio cardiovascolare hanno dimostrato che anche i complessi Hp 2-2 Hb vengono eliminati in modo meno efficiente rispetto ai complessi non Hp 2-2 Hb. Nei pazienti DM2 questo fenomeno è più pronunciato a causa della downregulation del CD163, in particolare nei soggetti Hp 2-2. Nei pazienti con Hp 2-2 si osserva anche una compromissione della segnalazione antinfiammatoria dei macrofagi attraverso un asse CD163/pAkt/IL-10.

   La clearance carente di Hp-Hb negli individui Hp 2-2 DM2 si traduce in un aumento del legame di Hp-Hb all'Apo A1 sulla lipoproteina ad alta densità (HDL-C), legando così la porzione pro-ossidativa dell'eme all'HDL. Ciò lo rende carente nella sua capacità di invertire il trasferimento del colesterolo dai macrofagi.

   La proteina Hp 2-2 è meno efficiente nel bloccare il trasferimento dell'eme da Hb rispetto a Hp 1-1. Inoltre, l'aumento del trasferimento dell'eme quando l'Hb è glicosilata può fornire una spiegazione meccanicistica per l'aumento delle malattie cardiovascolari osservate in Hp 2-2 DM2.

   Quindi il fenotipo Hp 2-2 è associato a ridotta capacità di legarsi con Hb, ridotta clearance dei complessi Hp 2-2 Hb, compromissione della via di segnalazione antinfiammatoria, aumento dell'ossidazione LDL, rende il colesterolo HDL inefficiente e meno efficiente nel bloccare il trasferimento dell'eme da Hb a Hp 1-1 tutti con un rischio cardiovascolare più elevato. Nei pazienti diabetici in cui anche alcuni di questi percorsi sono influenzati, l'effetto sinergico dell'iperglicemia e del fenotipo dell'aptoglobina è esacerbato portando a un rischio più elevato.

   In studi longitudinali condotti su altre popolazioni, è stato osservato che il genotipo Hp 2-2 è associato a un aumento del rischio di CVD incidente di 2-5 volte nei soggetti con DM. In particolare nello studio del cuore forte, l'odds ratio di avere CVD nei DM con fenotipo Hp 2-2 era 2-5 volte maggiore rispetto ai DM con fenotipo Hp 2-1 (p=0,002). Nello studio sullo stent di Monaco una serie consecutiva di 935 soggetti diabetici trattati è stata seguita per un anno dopo lo stent per eventi cardiaci avversi maggiori. In questo studio il fenotipo dell'aptoglobina 2-2 è stato considerato un predittore indipendente di eventi cardiaci avversi maggiori. Inoltre è stato visto che la vitamina E fornisce un sostanziale beneficio cardiovascolare ai pazienti con DM Hp 2-2 in una popolazione (Israel-ICARE STUDY) e l'analisi post-hoc dello studio WHS (Women Health Study) e HOPE per vedere se la vitamina L'integrazione con E nel sottogruppo di pazienti con il fenotipo dell'aptoglobina 2-2 influenzato dalla mortalità ha mostrato una riduzione non significativa della mortalità totale. Questo non è stato ampiamente adottato poiché sono necessari studi più ampi e su più popolazioni per comprovare l'associazione e i benefici.

   Hp fenotipo ed etnia

   In uno studio locale condotto a Singapore, si è visto che la frequenza dei geni Hp varia nelle diverse etnie come segue: Chinese Hp1:0.330;Hp2:0.670;Hp0: 0,029; Malesi:Hp1:0.298;Hp2:0.702 ;Hp0:0.004; Indiani Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. La distribuzione delle frequenze di Hp è stata vista essere all'equilibrio di Hardy-Weinberg nella nostra popolazione, quindi la prevalenza attesa di Hp 2-2 è di circa il 30-40%. I fenotipi di Hp saranno determinati mediante analisi TaqMan presso il TTSH Research Laboratory.

   1.2 Genotipi di aptoglobina e funzione endoteliale

   La disfunzione endoteliale ha ricevuto una crescente attenzione come potenziale contributo alla patogenesi della malattia vascolare nella DM. Nel DM2, il delicato equilibrio naturale nel rilascio di fattori contraenti e rilassanti da parte dell'endotelio è alterato, il che contribuisce a ulteriori danni vascolari e d'organo. È stato postulato che la funzione endoteliale compromessa fornisca un percorso comune finale attraverso il quale più fattori di rischio esercitano i loro effetti deleteri sulla salute cardiovascolare ed è stato stabilito come un potente marker surrogato per il rischio cardiovascolare con uno studio che mostra una prevedibilità ancora migliore rispetto al punteggio di rischio di Framingham. Verrà utilizzato il dispositivo EndoPAT 2000 poiché è stato stabilito per la stima della funzione endoteliale in modo non invasivo.

   Non sono stati condotti studi diretti sull'osservazione di un'associazione dei genotipi Hp alla funzione endoteliale, in uno studio pilota in cui la funzione endoteliale è stata valutata utilizzando l'iperemia reattiva post-ischemica e la pletismografia con estensimetro ed espressa come flusso massimo dopo un periodo ischemico, è stato osservato che i pazienti con Hp 2-2 con diabete avevano una funzione endoteliale peggiore rispetto ai pazienti senza Hp 2-2 (450 +-50 versus 600+-40).

   1.3 Genotipi di aptoglobina e CIMT (spessore dell'intima media carotidea)

   Nello studio Diabetes Heart, le analisi genetiche dei genotipi Hp hanno mostrato un'associazione tra il genotipo Hp 2-2 e lo spessore medio-intimo carotideo (CIMT). Queste misurazioni saranno effettuate con il soggetto sdraiato, con la testa estesa e leggermente ruotata opposta alla carotide esaminata, seguendo le raccomandazioni del Mannheim CIMT consensus. Due ricercatori hanno stimato il CIMT in 23 individui ed è stato tracciato un grafico di Bland-Altman e i limiti dell'accordo tra utenti sono risultati compresi tra -0,1 e +0,1.

   1.4 Genotipi di aptoglobina e rigidità dell'arteria aortica

   Sebbene non siano stati condotti studi diretti che confrontino i genotipi Hp e la rigidità dell'arteria aortica, è stato condotto uno studio in cui è stata valutata l'elasticità arteriosa delle arterie grandi e piccole utilizzando il metodo di analisi del contorno dell'onda del polso. L'indice di elasticità della grande arteria era più basso nei pazienti con Hp 2-2 rispetto a Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg contro 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   L'aumento della rigidità vascolare è stato osservato precocemente nel corso del diabete mellito di tipo 2 utilizzando il dispositivo sphygmocor. È probabile che questa rigidità sia correlata alla disfunzione endoteliale piuttosto che ad alterazioni vascolari strutturali, il che a sua volta suggerisce che sia reversibile. È stato anche osservato che la velocità dell'onda del polso aortico (PWV), una misura della distensibilità aortica, è predittiva della mortalità nei pazienti con diabete indipendentemente dai fattori confondenti noti. Verrà utilizzato il dispositivo SphygmoCor Xcel per stimare la rigidità dell'arteria aortica utilizzando la velocità dell'onda del polso carotideo-femorale e la pressione dell'aorta centrale. Gli investigatori stimeranno la velocità dell'onda del polso in 20 individui al fine di stabilire i limiti di accordo utilizzando il grafico di Bland-Altman prima di iniziare lo studio.

   1.5 Genotipi di aptoglobina e marcatori vascolari

   La molecola di adesione cellulare vascolare-1 (VCAM-1) e la molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1) sono proteine ​​espresse sulla superficie delle cellule endoteliali attivate (EC) ed espresse nell'aterosclerosi precoce. Questi marcatori sono stati valutati e considerati buoni marcatori di disfunzione endoteliale perché parte della proteina viene rilasciata nella circolazione e può essere rilevata nel plasma periferico.

   1.6 Genotipi di aptoglobina e fenotipizzazione dei lipidi plasmatici

   Il fenotipo Hp 2-2 è stato associato a concentrazioni più elevate di LDL ossidate, che sono principalmente coinvolte nell'aterosclerosi. È anche noto che le concentrazioni di Apo-A1 HDL sono più elevate in questo gruppo di pazienti. Il fenotipo Hp 2-2 può anche essere associato a concentrazioni più elevate di Lp(a) che mettono questi pazienti a più alto rischio cardiovascolare. Verrà eseguita una fenotipizzazione dettagliata dei lipidi plasmatici utilizzando la proteomica per cercare nuove associazioni.

   1.7 Genotipi di Aptoglobina e Stress Ossidativo

   È noto che il genotipo Hp 2-2 conferisce un maggiore stress ossidativo all'endotelio. Il potenziale ossidativo totale sarà calcolato come Oxidative-INDEX. Verranno eseguiti due test come segue per calcolare questo indice. Questo indice è stato stabilito come una buona stima dello stress ossidativo complessivo.

   1. Test d-ROMs: questo test verrà eseguito su campioni di siero utilizzando il metodo automatizzato d-ROMs. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Un punteggio di stress ossidativo come misura combinata delle controparti pro-ossidanti e antiossidanti nei pazienti con malattia coronarica. ClinBiochem 2008;41:1162-7)
   2. Per calcolare il punteggio dello stress ossidativo verranno utilizzati i test FRAP (ferric reduction capacity of plasma - una misura della capacità del plasma di prevenire danni ai vasi) e d-ROMs (derivati ​​per i metaboliti reattivi dell'ossigeno).

   Saranno misurati anche altri marcatori di stress ossidativo come gliossale, metilgliossale, dimetilarginina asimmetrica e omoarginina.

   1.8 Genotipi di aptoglobina e indice arterovenoso retinico

   La presenza di anomalie microvascolari retiniche, in particolare la costrizione arteriosa e la dilatazione venosa, è stata associata ad un aumentato rischio cardiovascolare ed è stata associata a disfunzione e infiammazione endoteliale. Attualmente non ci sono studi che esaminino la relazione tra genotipi Hp e indice arterovenoso retinico (AV). . Prima delle indagini, verranno instillati colliri per dilatare le pupille per l'esame del fondo oculare e per lubrificare la cornea. L'imaging retinico verrà eseguito per i soggetti presso la clinica oculistica. Se i pazienti non desiderano partecipare all'imaging retinico, possono scegliere di rinunciare al test di imaging retinico.

   2.0 Vitamina E, fenotipo di aptoglobina e riduzione del rischio cardiovascolare

   Mentre le differenze funzionali tra i prodotti proteici allelici Hp1 e Hp2, in particolare nel diabete mellito, possono spiegare le differenze nella suscettibilità alle complicanze negli individui Hp 2-2 rispetto a quelli non Hp 2-2, la ragione principale del beneficio unico della vitamina E è che l'Hb attiva redox è associato a HDL solo negli individui con Hp 2-2 DM. Nei pazienti con DM la diminuzione dei complessi Hp-Hb determina un aumento del legame Hp-Hb con l'Apo-A1 sulla lipoproteina ad alta densità (HDL), legando così la porzione pro-ossidativa dell'eme all'HDL. L'HDL negli individui con Hp 2-2 DM è carente nella sua capacità di stimolare il trasferimento inverso del colesterolo dai macrofagi. Oltre a questi, il fenotipo Hp 2-2 è associato ad un aumento dello stress ossidativo dovuto alla scarsa eliminazione dei radicali liberi e all'aumentata perossidazione delle LDL.

   La vitamina E è un potente antiossidante con proprietà antinfiammatorie. Allevia in modo significativo la condizione di stress ossidativo sia grazie alle sue potenti proprietà di scavenging dei radicali liberi sia interagendo direttamente e fortemente con gli enzimi antiossidanti. L'integrazione di vitamina E nell'uomo e nei modelli animali ha dimostrato di diminuire la perossidazione lipidica, la produzione di superossido e di diminuire l'espressione dei recettori scavenger (SR-A e CD36) che sono particolarmente importanti nella formazione delle cellule schiumose. Sebbene la vitamina E non abbia dimostrato di essere utile nel ridurre il rischio cardiovascolare nella popolazione generale, è risultata utile nei pazienti con fenotipo Hp 2-2 con DM, entrambe condizioni che aumentano sostanzialmente lo stress ossidativo negli studi condotti su una popolazione.

   Ci sono stati solo tre studi interventistici randomizzati controllati (RCT) in cui l'unico antiossidante che i partecipanti al DM hanno ricevuto era la vitamina E e in cui è stato determinato il tipo di Hp dei partecipanti allo studio. Lo studio ICARE è stato l'unico RCT mirato a valutare la vitamina E nei pazienti con DM per i quali è stato raccolto in modo prospettico il genotipo Hp. In questo studio, 1.434 individui con DM > o = 55 anni di età con il fenotipo Hp 2-2 sono stati randomizzati a ricevere vitamina E (400 UI/die/placebo). L'outcome composito primario è stato significativamente ridotto nei soggetti che ricevevano vitamina E (2,2%) rispetto al placebo (4,7%, p=0,001) a 18 mesi dall'inizio dello studio quando è stato terminato. Inoltre, i campioni di sangue di un sottogruppo di pazienti reclutati per gli studi WHS e HOPE sono stati analizzati per il polimorfismo Hp e gli esiti sono stati rivalutati in base al tipo di Hp del paziente. In tutti questi studi, è stato osservato un rischio più elevato di eventi cardiovascolari nei soggetti con Hp 2-2 e in questo gruppo è stato osservato un beneficio dall'integrazione di vitamina E.

   2.1 Giustificazione della dose e della durata della vitamina E (alfa-tocoferolo).

   Useremo vitamina E 400 UI al giorno e placebo abbinato. Incaricheremo la società Beacons che preparerà le capsule di vitamina E (400 UI) e le corrispondenti capsule di placebo. La preparazione della vitamina E sarà il tocoferolo naturale che si verifica nella configurazione RRR. Somministreremo vitamina E 400 UI per 6 mesi poiché la maggior parte degli studi che utilizzano marcatori surrogati del rischio cardiovascolare ha visto un miglioramento in 6 mesi dopo l'integrazione. Inoltre, nello studio ICARE sopra menzionato è stato osservato un miglioramento dell'esito cardiovascolare a 18 mesi, suggerendo quindi che 6 mesi dovrebbero essere una durata adeguata per vedere un miglioramento dei marcatori surrogati del rischio cardiovascolare.

   Le otto forme di vitamina E sono divise in due gruppi; quattro sono tocoferoli e quattro sono tocotrienoli. Sono identificati dai prefissi alfa- (α-), beta- (β-), gamma- (γ-) e delta- (δ-). L'alfa-tocoferolo è la forma più abbondante in natura, nota per avere la più alta attività biologica basata sui test di ricorso fetale e inverte i sintomi di carenza di vitamina E negli esseri umani. I tocoferoli naturali sono presenti solo nella configurazione RRR. La forma sintetica contiene otto diversi stereoisomeri ed è chiamata 'all-rac'-α-tocoferolo.

   La vitamina E si trova nella sua forma naturale negli oli vegetali (oli di germe di grano, girasole, cartamo, mais e soia), noci (mandorle, arachidi e nocciole), semi (semi di girasole), verdure a foglia verde (spinaci e broccoli) e fortificati cereali per la colazione, succhi di frutta, margarina e creme spalmabili. L'assunzione raccomandata dall'istituto di medicina per gli individui è di circa 15 mg al giorno. Il più alto livello sicuro di integratori di vitamina E per gli adulti è di 1.500 UI/giorno per le forme naturali di vitamina E e 1.000 UI/giorno per la forma artificiale (sintetica). I popolari integratori di vitamina E disponibili includono il D-alfa tocoferolo che è derivato da oli naturali. Gli integratori di vitamina E disponibili in commercio di solito contengono solo alfa-tocoferolo fornito non esterificato o come estere di acetato, succinato o nicotinato. Nell'uomo, l'alfa-tocoferolo libero ed esterificato hanno la stessa biodisponibilità. Gli integratori possono contenere l'alfa-tocoferolo naturale RRR o sintetico (all-rac). L'attività biologica dell'RRR alfa-tocoferolo naturale è superiore a quella del tutto-rac-alfa-tocoferolo sintetico e di altre forme naturali di vitamina E.

   Sia lo stress ossidativo che il corredo genetico individuale contribuiscono all'omeostasi della vitamina E negli esseri umani e questo può essere responsabile degli effetti clinici variabili osservati nel miglioramento delle variabili cliniche negli studi clinici. La vitamina E viene assorbita nell'intestino, entra in circolo attraverso il sistema linfatico dove assorbita insieme ai lipidi, viene impacchettata nei chilomicroni e trasportata al fegato. Dopo il passaggio attraverso il fegato, solo l'alfa-tocoferolo appare preferenzialmente nel plasma e la maggior parte delle altre forme di vitamina E viene preferenzialmente metabolizzata e secreta nella bile o non assorbita ed escreta nelle feci. Nel fegato, la proteina epatica di trasferimento dell'alfa-tocoferolo (α-TTP) seleziona specificamente la forma α con i 2R-stereoisomeri. L'incorporazione plasmatica di RRR-α-tocoferolo è un processo saturabile. I livelli plasmatici di RRR-α-tocoferolo cessano di aumentare a circa 80 μM nonostante l'aumento dei dosaggi di integrazione di vitamina E fino a 1.320 mg di tutto-rac-α-tocoferolo al giorno. Ciò è probabilmente secondario alla rapida sostituzione del circolante con α-tocoferolo appena assorbito e le analisi cinetiche dimostrano che l'intero pool di α-tocoferolo viene sostituito quotidianamente. Negli esseri umani, l'accumulo preferenziale di α-tocoferolo nel corpo dipende sia da un α-TTP funzionale che da un aumento del metabolismo e dell'escrezione di non-α-tocoferoli. La proteina di trasferimento dell'alfa-tocoferolo regola la distribuzione in tutto il corpo e le concentrazioni di vitamina E controllando la secrezione di vitamina E dal fegato. È stato visto che l'espressione del gene della proteina di trasferimento dell'alfa-tocoferolo può essere indotta dallo stress ossidativo e dall'ipossia, dagli agonisti del recettore nucleare PPARα e RXR e dall'aumento dei livelli di cAMP. Questo è mediato da un fattore di trascrizione già presente chiamato fattore di trascrizione cAMP response element-binding (CREB). I polimorfismi a singolo nucleotide che si trovano comunemente nelle persone sane influenzano drasticamente l'attività del promotore.

   Negli studi clinici sono state utilizzate varie dosi di vitamina E che vanno da 400 UI a 2.000 UI. L'istituto di medicina, USA, suggerisce un apporto dietetico raccomandato (RDA) di 15-1.000 mg/giorno (1 mg = 1,5 UI; 22,5-1.500 UI/giorno). Stiamo usando una dose di 400 UI per sei mesi. Non ci sono prove di effetti avversi se assunto entro la RDA, tuttavia può verificarsi tossicità emorragica a dosi elevate, specialmente nei pazienti in terapia con anticoagulanti. Quindi escluderemo i pazienti che assumono anticoagulanti.

   3.0 Considerazioni statistiche

   3.1 Calcolo della dimensione del campione: la dimensione complessiva stimata del campione per lo studio è di 300 pazienti. La dimensione del campione richiesta di 100 per ogni strato di fenotipo Hp della fase RCT si basa su: errore di tipo I del 5%; 90% di potenza; l'ipotesi che la vitamina E dovrebbe avere almeno un effetto moderato, rappresentato da una dimensione dell'effetto standardizzata (differenza media/errore standard raggruppato) di 0,5, su ciascun marcatore di rischio; test t su due campioni con uguale varianza; e un tasso di abbandono del 15%. Supponendo una prevalenza del 35% di Hp 2-2 nella nostra popolazione, abbiamo bisogno di sottoporre a screening 300 pazienti per reclutare 100 pazienti con fenotipo Hp 2-2.

   Supponendo una differenza media su RHI di 0,25 unità con una deviazione standard (SD) corrispondente di 0,3, ottenendo una dimensione dell'effetto standardizzata di 0,25/0,3 = 0,83 come differenza minima in RHI osservata in un altro studio. Non abbiamo effettuato aggiustamenti per test/confronti multipli a causa della natura pilota dell'RCT, nonché della natura esplorativa dello studio in generale.

   La dimensione del campione per lo studio in vitro è limitata da risorse limitate. Tuttavia, i risultati della simulazione basati su un test Wilcoxon Signed-Ranked a due code, errore di tipo I del 5%, una correlazione tra coppie di 0,5 e 5000 campioni di simulazione Monte Carlo indicano che 20 coppie forniscono una potenza adeguata per rilevare dimensioni dell'effetto standardizzate da moderate a grandi (M1).

   La randomizzazione sarà effettuata elettronicamente attraverso il web - un sito intranet centralizzato protetto da password per garantire che i pazienti siano randomizzati nel momento in cui sono idonei per lo studio (rigorosamente sequenziale). Verrà impiegato un programma di randomizzazione bloccato, in blocchi di 10, per lo studio basato su un rapporto di allocazione 1:1. Il sito dedicato protetto da password assegnerà quindi un numero di prova univoco del paziente che corrisponderà ai numeri di trattamento etichettati nelle scatole dei farmaci. Dopo la randomizzazione, al paziente verrà somministrata la prima dose.

   3.2 Gestione dei dati e analisi statistiche: Gestione dei dati Tutti i dati pertinenti saranno raccolti utilizzando appositi moduli di raccolta dei dati dello studio ben progettati ad ogni visita e valutazione telefonica di follow-up. Tutti i dati dello studio saranno archiviati in un database dello studio valutabile solo per l'inserimento dei dati e il personale dello studio per la convalida dei dati.

   Piano di analisi statistica I dati sulle variabili demografiche e cliniche di base, nonché i marcatori di rischio, saranno riassunti per fenotipi Hp e in generale per fornire informazioni sulle potenziali associazioni. I dati binari saranno riassunti utilizzando la frequenza e le proporzioni. Il test del chi-quadrato e il test esatto di Fisher saranno utilizzati per valutare le associazioni rilevanti (inclusi i benefici della vitamina E) e, se necessario, verrà utilizzata la regressione logistica per caratterizzare le associazioni tenendo conto di potenziali fattori confondenti. Le variabili continue saranno riassunte utilizzando medie (deviazioni standard) o mediane (range) come ritenuto appropriato. Verranno utilizzati due campioni t-test o test di Mann-Whitney per valutare le associazioni rilevanti e verranno utilizzati modelli lineari generalizzati per caratterizzare le associazioni mentre si correggono per potenziali fattori confondenti. I modelli lineari generalizzati sono considerati in quanto possono accogliere dati non normali (asimmetrici) o dati log-normali (come i dati di laboratorio) se necessario. Verranno eseguiti test e modelli separati per ciascun risultato rilevante.

   I dati dello studio in vitro saranno riassunti in modo simile a quanto descritto nel paragrafo precedente, in base allo stato del fenotipo Hp 2-2 e alle concentrazioni di vitamina E. Il test Wilcoxon Signed-Ranked sarà utilizzato per valutare i benefici della vitamina E tra i gruppi fenotipici Hp in base alle concentrazioni. I test di Mann-Whitney e Jonckheere-Terpstra saranno utilizzati per valutare la relazione concentrazione-beneficio della vitamina E per gruppi fenotipici Hp. Saranno impiegati modelli misti lineari generalizzati per esplorare varie tendenze e associazioni tenendo conto di (i) l'abbinamento di pazienti Hp 2-2 e non Hp 2-2, (ii) valutazione ripetuta all'interno di un paziente in base alla concentrazione di vitamina E, (iii) aggiustamento per potenziali fattori confondenti e (iv) aggiustamento per potenziale non normalità (asimmetria) dei dati utilizzando altre distribuzioni appropriate come distribuzioni log-normali o gamma. Verrà effettuata un'analisi complessiva dei dati dello studio in vitro.

   L'analisi di Bland-Altman sarà utilizzata per stimare e valutare i limiti di concordanza per gli studi di concordanza e affidabilità. Se del caso, verrà utilizzato un approccio basato su modelli misti per stimare e valutare i coefficienti di affidabilità pertinenti.

   5.0 Significato clinico

   Se si osserva un'associazione tra il fenotipo Hp 2-2 e il rischio cardiovascolare, questo gruppo di pazienti può essere preso di mira per il trattamento con vitamina E in aggiunta alle statine e ad altri trattamenti convenzionali per ridurre il rischio cardiovascolare. Un futuro RCT su larga scala a livello nazionale può essere pianificato per vedere se il trattamento con vitamina E aiuta a ridurre il rischio in questo gruppo di pazienti. Condurre tali studi in una popolazione multietnica è imperativo in quanto fornisce informazioni sulla coerenza e la generalizzabilità dei benefici attesi.