Vztah fenotypu haptoglobinu k vaskulární funkci a odpovědi na suplementaci vitaminu E u pacientů s diabetes mellitus 2. typu: studie EVAS (EVAS)

1.0 Pozadí a klinický význam 1.1 Úvod Incidence diabetu mellitu typu 2 (DM2) rychle roste celosvětově i v Singapuru. Hlavní příčinou zvýšené morbidity a mortality pacientů s DM2 je rozvoj mikrovaskulárních a makrovaskulárních komplikací. Ačkoli bylo prokázáno, že přísná kontrola glykémie snižuje mikrovaskulární komplikace, stále chybí důkazy o makrovaskulárních komplikacích. Akcelerovaná ateroskleróza je hlavní příčinou zvýšené mortality a morbidity u těchto pacientů. Je nanejvýš důležité vyhodnotit nové cíle pro kontrolu aterosklerózy u pacientů s DM2 vedle konvenční léčby. Existuje nesplněná potřeba nalézt nové cíle nebo markery předpovídající zvýšené riziko u pacientů s diabetes mellitus a musíme zvážit alternativní léčbu nad rámec konvenčních cílů, abychom snížili riziko u těchto vysoce rizikových pacientů.

Pacienti s DM2 jsou nejen vystaveni zvýšenému riziku aterosklerózy, ale nesou i větší rozsah chorobné zátěže. Endoteliální dysfunkce je považována za charakteristický znak patologického poškození krevních cév. Hyperglykémie ovlivňuje mitochondriální, enzymatické a neenzymatické dráhy spojené s tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS), což vede ke snížení biologické dostupnosti oxidu dusnatého a dysfunkci endotelu, což se běžně projevuje sníženou vazodilatací závislou na endotelu a zvýšenými hladinami regulačních proteinů odvozených od endotelu v plazmě. Navíc mají pacienti s DM2 narušenou antioxidační obranu v podobě nízkých hladin antioxidačních enzymů a alfa-tokoferolu (vitamín E), což může bránit adekvátní kompenzaci nárůstu oxidačního stresu. Další role oxidačního stresu při zprostředkování rozvoje aterosklerózy byla prokázána také v oxidativní hypotéze. V tomto modelu je nejvýznamnějším cílem oxidativní modifikace molekula LDL. Oxidovaný LDL není rozpoznáván LDL receptorem, ale je snadno vychytáván dráhou lapače CD36 v makrofázích, což vede ke značné akumulaci cholesterylesteru a tvorbě pěnových buněk. Oxidovaný LDL je prozánětlivý, způsobuje inhibici endoteliální NO syntetázy, podporuje vazokonstrikci a adhezi monocytů, podporuje agregaci krevních destiček a trombózu.

Fenotyp Hp a oxidativní poškození tkáně

Protein haptoglobin (Hp) je antioxidant díky své schopnosti neutralizovat oxidační aktivitu hemoglobinu (Hb). U lidí je Hp charakterizován genetickým polymorfismem se třemi strukturně odlišnými fenotypy (Hp1-1, Hp 2-1 a Hp 2-2, které jsou výsledkem exprese dvou různých alel (Hp 1 a Hp 2) genu haptoglobinu umístěného na chromozom 16q22. Proteinový produkt alely Hp2 je ve srovnání s produktem alely Hp1 méně kvalitním antioxidantem. Hp 1-1 je malá molekula (86 kDa) s dobře definovanou strukturou, zatímco Hp 2-1 je charakterizována heteropolymery (86-300 kDA) a Hp 2-2 tvoří velké makromolekulární komplexy (170-1 000 kDa).

Funkcí Hp je vázat volný Hb uvolněný z červených krvinek, který se uvolňuje do krve během přirozeného obratu červených krvinek. Volný Hb je schopen způsobit značné oxidační poškození tkání v důsledku svého hemového železa. Kdykoli se však Hb uvolní do oběhu, okamžitě se naváže na Hp s extrémně vysokou afinitou a vytvoří komplex Hp-Hb. Tato vazba slouží k inhibici oxidačního potenciálu Hb tím, že brání uvolňování hemového železa z Hb. Hp se normálně nachází v krvi ve více než 400násobném molárním přebytku k volnému Hb, a proto je Hp schopen vázat veškerý Hb, který se uvolňuje během normálního obratu červených krvinek. Jakmile je Hb navázán na Hp, je rychle odstraněn z krevního řečiště prostřednictvím CD163 scavenger receptoru exprimovaného na monocytech/makrofázích, avšak tvorba a clearance komplexů Hp-Hb jsou u fenotypů Hp 2-2 narušeny.

Železo odvozené od Hb může katalyzovat řadu oxidačních reakcí, které mohou být inhibovány Hp.

1. Železné hemové železo (Fe2+) může reagovat s peroxidem vodíku za vzniku železitého Hb (Fe3+) a vysoce reaktivních hydroxylových radikálů. Abstrahováním atomu vodíku z polynenasycených mastných kyselin mohou hydroxylové radikály zahájit proces peroxidace lipidů.
2. Ferrous Hb (Fe2+) může také reagovat s peroxidem vodíku za vzniku ferryl Hb (Fe4+), vysoce nestabilní molekuly, která snadno reaguje s druhou molekulou peroxidu vodíku za vzniku železitého Hb (Fe3+) a superoxidového aniontu. Škodlivé účinky superoxidového aniontu jsou dvojí: redukce trojmocného železa (Fe3+) v Hb na železnaté železo (Fe2+), umožňující produkci dalšího hydroxylového radikálu, jak je popsáno v reakci 1, a dismutace superoxidového aniontu za vzniku peroxidu vodíku. , opět propagující výrobu ROS.

3. Ferric Hb (obsahující Fe3+), také známý jako methemoglobin, může spontánně přenášet svou hemovou skupinu, což vede ke vstupu hemu do různých lipofilních prostředí, jako jsou LDL nebo buněčné membrány. Po interkalaci do svého nového lipidového prostředí může hemové železo podléhat reakcím s peroxidem vodíku, jak je popsáno výše, nebo s přilehlými lipidovými peroxidy vytvářejícími kaskádu volných radikálů a vedoucí k rozsáhlé oxidaci lipidů.

   Jako součást komplexu Hp-Hb stabilizuje Hp hem v hemové kapse Hb a zabraňuje Hb způsobit oxidační poškození. Míra, do jaké Hp neutralizuje redoxní aktivitu hemového železa, se však mezi typy Hp liší. To bylo prokázáno v řadě systémů in vitro i in vivo. Například studie s použitím kyseliny linolenové ukázaly, že Hp 1-1 zabraňuje oxidaci (tvorbě dienu), jak bylo měřeno zvýšením absorbance při 232 nm ve větší míře než Hp 2-2. Další studie zkoumala oxidaci LDL v důsledku přenosu hemu z Hb na LDL. Přenos hemu byl měřen zhášením fluorescenčního signálu emitovaného dansylovaným LDL. Bylo zjištěno, že Hp 1-1 byl lepší v prevenci přenosu hemu z Hb ve srovnání s Hp 2-2.

   Fenotypy Hp a kardiovaskulární riziko Studie ukázaly, že komplexy Hp 2-2 Hb jsou také odstraňovány méně účinně než komplexy non Hp 2-2 Hb. U pacientů s DM2 je tento fenomén výraznější v důsledku downregulace CD163, zejména u jedinců Hp 2-2. U pacientů s Hp 2-2 je také pozorováno zhoršení signalizace protizánětlivých makrofágů prostřednictvím osy CD163/pAkt/IL-10.

   Odstraňování deficitu Hp-Hb u jedinců s Hp 2-2 DM2 vede ke zvýšené vazbě Hp-Hb k Apo A1 na lipoproteinu s vysokou hustotou (HDL-C), čímž se prooxidační hemová skupina připoutá k HDL. To způsobuje, že má nedostatečnou schopnost zvrátit přenos cholesterolu z makrofágů.

   Protein Hp 2-2 je méně účinný při blokování přenosu hemu z Hb ve srovnání s Hp 1-1. Navíc zvýšení přenosu hemu, když je Hb glykosylován, může poskytnout mechanické vysvětlení pro zvýšení kardiovaskulárního onemocnění pozorovaného u Hp 2-2 DM2.

   Fenotyp Hp 2-2 je tedy spojen se sníženou schopností vázat se na Hb, sníženou clearance komplexů Hp 2-2 Hb, poškozením protizánětlivé signální dráhy, zvýšenou oxidací LDL, činí HDL-cholesterol neúčinným a méně účinným při blokování přenosu hemu. z Hb na Hp 1-1, to vše vede k vyššímu kardiovaskulárnímu riziku. U diabetiků, kde jsou některé z těchto drah také ovlivněny, se synergický efekt hyperglykémie a fenotypu haptoglobinu zhoršuje, což vede k vyššímu riziku.

   V longitudinálních studiích provedených v jiných populacích bylo pozorováno, že genotyp Hp 2-2 je spojen s 2-5krát zvýšeným rizikem výskytu KVO u jedinců s DM. Zejména ve studii silného srdce byl poměr pravděpodobnosti mít CVD u DM s fenotypem Hp 2-2 2-5krát vyšší než u DM s fenotypem Hp 2-1 (p=0,002). V mnichovské studii stentu byla sledována série 935 léčených diabetiků po dobu jednoho roku po zavedení stentu pro závažné nežádoucí srdeční příhody. V této studii bylo pozorováno, že fenotyp haptoglobinu 2-2 je nezávislým prediktorem závažných nežádoucích srdečních příhod. Kromě toho bylo pozorováno, že vitamin E poskytuje podstatný kardiovaskulární přínos pacientům s Hp 2-2 DM v jedné populaci (Izrael-ICARE STUDY) a post-hoc analýza WHS (Women Health Study,) a studie HOPE, aby se zjistilo, zda vitamin Suplementace E v podskupině pacientů s úmrtností ovlivněnou fenotypem haptoglobinu 2-2 prokázala nevýznamné snížení celkové mortality. Toto nebylo široce přijato, protože jsou zapotřebí větší studie a na více populacích, aby se potvrdila souvislost a přínosy.

   Fenotyp a etnická příslušnost Hp

   V místní studii provedené v Singapuru bylo vidět, že frekvence Hp genů se u různých etnik liší následovně: čínský Hp1:0,330;Hp2:0,670;Hp0: 0,029; Malajština: Hp1:0,298; Hp2:0,702 Hp0:0,004; Indové Hp1: 0,167;Hp2:0,833;Hp0:0,009. Bylo zjištěno, že distribuce frekvencí Hp je v naší populaci v Hardy-Weinbergově rovnováze, takže očekávaná prevalence Hp 2-2 je kolem 30-40 %. Fenotypy Hp budou stanoveny analýzou TaqMan ve výzkumné laboratoři TTSH.

   1.2 Haptoglobinové genotypy a funkce endotelu

   Endoteliální dysfunkci je věnována stále větší pozornost jako potenciálnímu přispěvateli k patogenezi vaskulárního onemocnění u DM. U DM2 je pozměněna přirozená křehká rovnováha v uvolňování kontrakčních a relaxačních faktorů endotelem, což přispívá k dalšímu poškození cév a koncových orgánů. Předpokládá se, že narušená endoteliální funkce poskytuje konečnou společnou cestu, kterou mnohočetné rizikové faktory uplatňují své škodlivé účinky na kardiovaskulární zdraví, a byla stanovena jako silný náhradní marker kardiovaskulárního rizika, přičemž jedna studie prokázala ještě lepší předvídatelnost než skóre rizika ve Framinghamu. Použije se zařízení EndoPAT 2000, které bylo zavedeno pro odhad funkce endotelu neinvazivním způsobem.

   Neexistují žádné přímé studie, které by sledovaly asociaci genotypů Hp k endoteliální funkci, v jedné pilotní studii, kde byla endoteliální funkce hodnocena pomocí postischemické reaktivní hyperémie a tenzometrické pletysmografie a vyjádřena jako maximální průtok po ischemickém období, bylo pozorováno že Hp 2-2 pacienti s diabetem měli horší endoteliální funkci ve srovnání s non Hp 2-2 pacienty (450 +-50 versus 600 +-40).

   1.3 Haptoglobinové genotypy a CIMT (tloušťka karotidové intimy)

   Ve studii Diabetes Heart prokázaly genetické analýzy genotypů Hp souvislost mezi genotypem Hp 2-2 a tloušťkou karotidové intimy media (CIMT). Tato měření se provedou s ležícím subjektem, s hlavou nataženou a mírně otočenou proti zkoumané karotidě, v souladu s doporučeními konsensu CIMT z Mannheimu. Dva výzkumníci odhadli CIMT u 23 jedinců a byl vykreslen Bland-Altmanův graf. a bylo zjištěno, že meze dohody mezi uživateli jsou v rozmezí -0,1 až +0,1.

   1.4 Haptoglobinové genotypy a tuhost aorty

   Přestože nebyly provedeny žádné přímé studie srovnávající genotypy Hp a tuhost aortální tepny, byla provedena jedna studie, ve které hodnotili arteriální elasticitu velkých a malých tepen pomocí metody analýzy obrysu pulzních vln. Index elasticity velkých tepen byl nižší u pacientů s Hp 2-2 ve srovnání s Hp 1-1 (8,4 +-2,3 ml/mmHg versus 12,6 +-4,1 ml/mmHg x 100; p

   Zvýšená vaskulární tuhost byla pozorována časně v průběhu Diabetes Mellitus Type 2 pomocí zařízení sphygmocor. Je pravděpodobné, že tato ztuhlost souvisí spíše s endoteliální dysfunkcí než strukturálními vaskulárními změnami – to zase naznačuje, že je reverzibilní. Rychlost aortální pulzní vlny (PWV), měřítko roztažnosti aorty, také předpovídá mortalitu u pacientů s diabetem nezávisle na známých matoucích faktorech. K odhadu tuhosti aortální tepny bude použit přístroj SphygmoCor Xcel pomocí rychlosti pulzní vlny karotické až femorální a centrálního aortálního tlaku. Před zahájením studie vědci odhadnou rychlost pulzní vlny u 20 jedinců, aby stanovili hranice shody pomocí Bland-Altmanova grafu.

   1.5 Haptoglobinové genotypy a vaskulární markery

   Vaskulární buněčná adhezní molekula-1 (VCAM-1) a intercelulární adhezní molekula-1 (ICAM-1) jsou proteiny exprimované na povrchu aktivovaných endoteliálních buněk (EC) a exprimované v časné ateroskleróze. Tyto markery byly hodnoceny a považovány za dobré markery endoteliální dysfunkce, protože část proteinu se uvolňuje v oběhu a může být detekována v periferní plazmě.

   1.6 Haptoglobinové genotypy a fenotypizace plazmatických lipidů

   Fenotyp Hp 2-2 je spojován s vyššími koncentracemi oxidovaného LDL, který se primárně podílí na ateroskleróze. Je také známo, že koncentrace Apo-A1 HDL jsou u této skupiny pacientů vyšší. Fenotyp Hp 2-2 může být také spojen s vyššími koncentracemi Lp(a), čímž jsou tyto pacienty vystaveny vyššímu kardiovaskulárnímu riziku. Bude provedena podrobná fenotypizace plazmatických lipidů pomocí proteomiky za účelem hledání nových asociací.

   1.7 Haptoglobinové genotypy a oxidační stres

   Je známo, že genotyp Hp 2-2 uděluje endotelu vyšší oxidační stres. Celkový oxidační potenciál bude vypočítán jako oxidační INDEX. Pro výpočet tohoto indexu budou provedeny dva následující testy. Tento index byl stanoven jako dobrý odhad celkového oxidačního stresu.

   1. Test d-ROM: Tento test bude proveden na vzorcích séra pomocí automatizované metody d-ROM. (Vassalle C, Pratali L, Boni C, Mercuri A, Ndreu R. Skóre oxidačního stresu jako kombinované měření prooxidačních a antioxidačních protějšků u pacientů s onemocněním koronárních tepen. Clin Biochem 2008;41:1162-7)
   2. K výpočtu skóre oxidačního stresu bude použit test FRAP (ferric redukční schopnost plazmy - míra schopnosti plazmy zabránit poškození cév) a d-ROMs (deriváty pro metabolity reaktivního kyslíku).

   Dále budou měřeny další markery oxidačního stresu, jako je glyoxal, methylglyoxal, asymetrický dimethylarginin a homoarginin.

   1.8 Haptoglobinové genotypy a retinální Arteriovenózní index

   Přítomnost retinálních mikrovaskulárních abnormalit, zejména arteriální konstrikce a venulární dilatace, byla spojena se zvýšeným kardiovaskulárním rizikem a byla spojena s endoteliální dysfunkcí a zánětem. V současné době neexistují žádné studie zabývající se vztahem mezi genotypy Hp a retinálním arteriovenózním (AV) indexem. . Před vyšetřením se kápnou oční kapky k rozšíření zorniček pro vyšetření očního pozadí a k lubrikaci rohovky. Zobrazování sítnice bude subjektům provedeno na oční klinice. Pokud si pacienti nepřejí účastnit se zobrazení sítnice, mohou se rozhodnout odhlásit se z testu zobrazení sítnice.

   2.0 Vitamin E, fenotyp haptoglobinu a snížení kardiovaskulárního rizika

   Zatímco funkční rozdíly mezi produkty alelického proteinu Hp1 a Hp2, zejména u DM, mohou vysvětlit rozdíly v náchylnosti ke komplikacím u jedinců s Hp 2-2 od jedinců bez Hp 2-2, hlavním důvodem jedinečného přínosu vitaminu E je redoxně aktivní Hb je spojena s HDL pouze u Hp 2-2 jedinců DM. U pacientů s DM vedou snížené komplexy Hp-Hb ke zvýšené vazbě Hp-Hb na Apo-A1 na lipoproteinu s vysokou hustotou (HDL), čímž se prooxidační hemová skupina připoutá k HDL. HDL u jedinců s Hp 2-2 DM je nedostatečný ve své schopnosti stimulovat zpětný přenos cholesterolu z makrofágů. Kromě toho je fenotyp Hp 2-2 spojen se zvýšeným oxidačním stresem v důsledku nedostatečné clearance volných radikálů a zvýšené peroxidace LDL.

   Vitamin E je silný antioxidant s protizánětlivými vlastnostmi. Významně zmírňuje stavy oxidačního stresu jak svými silnými schopnostmi pohlcovat volné radikály, tak přímou a silnou interakcí s antioxidačními enzymy. Suplementace vitaminu E u lidí a zvířecích modelů prokázala snížení peroxidace lipidů, produkci superoxidu a snížení exprese scavengerových receptorů (SR-A a CD36), které jsou zvláště důležité při tvorbě pěnových buněk. Ačkoli nebylo prokázáno, že vitamin E je užitečný při snižování kardiovaskulárního rizika v obecné populaci, byl užitečný u pacientů s fenotypem Hp 2-2 s DM, což jsou oba stavy, které podstatně zvyšují oxidační stres ve studiích provedených na jedné populaci.

   Proběhly pouze tři intervenční randomizované kontrolované studie (RCT), ve kterých jediným antioxidantem, který účastníci DM dostávali, byl vitamin E a ve kterých byl stanoven typ Hp účastníků studie. Studie ICARE byla jedinou RCT zaměřenou na hodnocení vitaminu E u pacientů s DM, u kterých byl prospektivně získán genotyp Hp. V této studii bylo 1 434 jedinců s DM > nebo = 55 let s fenotypem Hp 2-2 randomizováno k vitaminu E (400 IU/den/placebo). Primární složený výsledek byl významně snížen u jedinců užívajících vitamin E (2,2 %) ve srovnání s placebem (4,7 %, p=0,001) 18 měsíců po zahájení studie, když byla ukončena. Kromě toho byly vzorky krve od podskupiny pacientů zařazených do studií WHS a HOPE analyzovány na polymorfismus Hp a výsledky byly přehodnoceny podle typu Hp pacienta. Ve všech těchto studiích bylo pozorováno vyšší riziko kardiovaskulárních příhod u jedinců s Hp 2-2 a v této skupině byl pozorován přínos suplementace vitaminem E.

   2.1 Odůvodnění dávky a trvání vitaminu E (alfa-tokoferol).

   Budeme používat vitamín E 400 IU denně a odpovídající placebo. Pověříme společnost Beacons, která připraví kapsle vitaminu E (400 IU) a odpovídající placebo kapsle. Preparát vitaminu E bude přírodní tokoferol, který se vyskytuje v konfiguraci RRR. Vitamín E budeme podávat 400 IU po dobu 6 měsíců, protože většina studií používajících náhradní markery kardiovaskulárního rizika zaznamenala zlepšení do 6 měsíců po suplementaci. Navíc ve výše uvedené studii ICARE bylo pozorováno zlepšení kardiovaskulárního výsledku po 18 měsících, což naznačuje, že 6 měsíců by mělo být adekvátní dobou ke zlepšení náhradních markerů kardiovaskulárního rizika.

   Osm forem vitaminu E se dělí do dvou skupin; čtyři jsou tokoferoly a čtyři jsou tokotrienoly. Jsou identifikovány předponami alfa- (α-), beta- (β-), gama- (γ-) a delta- (δ-). alfa-tokoferol je v přírodě nejrozšířenější formou, o které je známo, že má nejvyšší biologickou aktivitu založenou na testech fetálních rezortů a ruší symptomy nedostatku vitaminu E u lidí. Přírodní tokoferoly se vyskytují pouze v konfiguraci RRR. Syntetická forma obsahuje osm různých stereoizomerů a nazývá se „all-rac“-α-tokoferol.

   Vitamin E se v přirozené formě vyskytuje v rostlinných olejích (olej z pšeničných klíčků, slunečnicový, světlicový, kukuřičný a sójový), ořechů (mandle, arašídy a lískové ořechy), semenech (slunečnicová semínka), zelené listové zelenině (špenát a brokolice) a obohacené snídaňové cereálie, ovocné šťávy, margarín a pomazánky. Institut medicíny doporučený příjem pro jednotlivce je asi 15 mg/den. Nejvyšší bezpečná hladina doplňků vitaminu E pro dospělé je 1 500 IU/den pro přírodní formy vitaminu E a 1 000 IU/den pro umělou (syntetickou) formu. Mezi oblíbené dostupné doplňky vitaminu E patří D-alfa tokoferol, který je odvozen z přírodních olejů. Komerčně dostupné doplňky vitaminu E obvykle obsahují pouze alfa-tokoferol dodávaný buď neesterifikovaný, nebo jako ester acetátu, sukcinátu nebo nikotinátu. U lidí má volný a esterifikovaný alfa-tokoferol stejnou biologickou dostupnost. Doplňky mohou obsahovat buď přírodní RRR- nebo syntetický (all-rac) alfa-tokoferol. Biologická aktivita přírodního RRR alfa-tokoferolu je vyšší než u syntetického all-rac-alfa-tokoferolu a dalších přírodních forem vitaminu E.

   Jak oxidační stres, tak individuální genetická výbava přispívají k homeostáze vitaminu E u lidí, což může být zodpovědné za různé klinické účinky pozorované při zlepšování klinických proměnných v klinických studiích. Vitamin E se vstřebává ve střevě, dostává se do oběhu lymfatickým systémem, kde se vstřebává spolu s lipidy, je zabalen do chylomikronů a transportován do jater. Po průchodu játry se v plazmě přednostně objevuje pouze alfa-tokoferol a většina ostatních forem vitaminu E je přednostně metabolizována a buď sekretována žlučí, nebo není vychytávána a vylučována stolicí. V játrech jaterní přenosový protein alfa-tokoferolu (α-TTP) specificky třídí a-formu s 2R-stereoizomery. Inkorporace RRR-a-tokoferolu do plazmy je saturovatelný proces. Plazmatické hladiny RRR-α-tokoferolu se přestávají zvyšovat při přibližně 80 μM navzdory zvyšujícím se dávkám suplementace vitaminem E až na 1 320 mg all-rac-α-tokoferolu denně. To je pravděpodobně sekundární k rychlému nahrazení cirkulace nově absorbovaným α-tokoferolem a kinetické analýzy ukazují, že celá zásoba α-tokoferolu je nahrazena denně. U lidí je preferenční akumulace a-tokoferolu v těle závislá jak na funkčním a-TTP, tak na zvýšeném metabolismu a vylučování non-a-tokoferolů. Protein přenosu alfa-tokoferolu reguluje distribuci vitaminu E v celém těle a koncentraci vitaminu E řízením sekrece vitaminu E z jater. Bylo vidět, že exprese genu pro přenosový protein alfa-tokoferolu může být indukována oxidačním stresem a hypoxií, agonisty jaderného receptoru PPARa a RXR a zvýšením hladin cAMP. To je zprostředkováno již přítomným transkripčním faktorem zvaným cAMP response element-binding (CREB) transkripční faktor. Jednonukleotidové polymorfismy, které se běžně vyskytují u zdravých lidí, drasticky ovlivňují aktivitu promotoru.

   V klinických studiích byly použity různé dávky vitaminu E v rozmezí od 400 IU do 2 000 IU. Institut medicíny v USA navrhuje doporučený dietní příjem (RDA) 15-1 000 mg/den (1 mg = 1,5 IU; 22,5-1 500 IU/den). Užíváme dávku 400 IU po dobu šesti měsíců. Neexistují žádné důkazy o nežádoucích účincích, pokud jsou užívány v rámci doporučené denní dávky, avšak ve vysokých dávkách může dojít ke hemoragické toxicitě, zejména u pacientů užívajících antikoagulancia. Vyloučíme proto pacienty na antikoagulanciích.

   3.0 Statistická hlediska

   3.1 Výpočet velikosti vzorku: Celková odhadovaná velikost vzorku pro studii je 300 pacientů. Požadovaná velikost vzorku 100 pro každou vrstvu fenotypu Hp fáze RCT je založena na: 5 % chyby typu I; 90 % výkonu; předpoklad, že se očekává, že vitamín E bude mít alespoň mírný účinek, reprezentovaný standardizovanou velikostí účinku (průměrný rozdíl/sdružená standardní chyba) 0,5 na každý marker rizika; dvouvýběrový t-test se stejným rozptylem; a 15% míra opuštění. Za předpokladu 35% prevalence Hp 2-2 v naší populaci potřebujeme provést screening 300 pacientů, abychom získali 100 pacientů s fenotypem Hp 2-2.

   Za předpokladu průměrného rozdílu na RHI 0,25 jednotek s odpovídající směrodatnou odchylkou (SD) 0,3 – výsledkem je standardizovaná velikost účinku 0,25/0,3 = 0,83 jako minimální rozdíl v RHI pozorovaný v jiné studii. Neupravili jsme pro vícenásobné testování/srovnání kvůli pilotní povaze RCT, stejně jako průzkumné povaze studie obecně.

   Velikost vzorku pro studii in vitro je omezena omezenými zdroji. Nicméně výsledky simulace založené na oboustranném testu Wilcoxon Signed-Ranked, 5% chyba typu I, korelace mezi páry 0,5 a 5000 simulačních vzorků Monte Carlo naznačují, že 20 párů poskytuje dostatečný výkon pro detekci středních až velkých velikostí standardizovaných efektů. (M1).

   Randomizace bude provedena elektronicky prostřednictvím webu – centralizované intranetové webové stránky chráněné heslem, aby bylo zajištěno, že pacienti budou randomizováni v okamžiku, kdy jsou způsobilí pro studii (přísně sekvenční). Pro studii bude použit blokovaný randomizační plán v blocích po 10 na základě alokačního poměru 1:1. Vyhrazená stránka chráněná heslem pak přidělí jedinečné číslo pacientské zkoušky, které bude odpovídat číslům léčby označeným v krabicích s léky. Po randomizaci bude pacientovi podána první dávka.

   3.2 Nakládání s daty a statistické analýzy: Nakládání s daty Všechny relevantní údaje budou shromažďovány pomocí vhodných dobře navržených formulářů pro sběr dat ze studií při každé návštěvě a následném telefonickém hodnocení. Všechna data studie budou uložena v databázi studie, kterou mohou hodnotit pouze pracovníci studie pro zadávání dat a validaci dat.

   Plán statistické analýzy Údaje o výchozích demografických a klinických proměnných a také rizikové markery budou shrnuty podle fenotypů Hp a celkově tak, aby poskytly náhled na potenciální souvislosti. Binární data budou sumarizována pomocí frekvence a proporcí. Chí-kvadrát test a Fisherův exaktní test budou použity k vyhodnocení relevantních asociací (včetně přínosů vitaminu E) a v případě potřeby bude použita logistická regrese k charakterizaci asociací při úpravě na potenciální zmatky. Spojité proměnné budou sumarizovány pomocí průměrů (směrodatné odchylky) nebo mediánu (rozpětí), jak to bude považováno za vhodné. K vyhodnocení relevantních asociací bude použit dvouvzorkový t-test nebo Mann-Whitney test a zobecněné lineární modely budou použity k charakterizaci asociací při úpravě na potenciální zmatky. Uvažují se zobecněné lineární modely, protože mohou v případě potřeby pojmout nenormální (asymetrická) data nebo logaritmicky normální data (jako jsou laboratorní data). Pro každý relevantní výsledek budou provedeny samostatné testy a modely.

   Data ze studie in vitro budou shrnuta podobně, jak je popsáno v předchozím odstavci, podle stavu fenotypu Hp 2-2 a koncentrací vitaminu E. Wilcoxon Signed-Ranked test bude použit k vyhodnocení přínosů vitaminu E mezi skupinami fenotypu Hp podle koncentrací. Mann-Whitney a Jonckheere-Terpstra test budou použity k vyhodnocení vztahu koncentrace-prospěch vitaminu E podle fenotypových skupin Hp. Generalizované lineární smíšené modely budou použity k prozkoumání různých trendů a asociací při zohlednění (i) shody pacientů s Hp 2-2 a non Hp 2-2, (ii) opakovaného hodnocení u pacienta podle koncentrace vitaminu E, (iii) přizpůsobení pro potenciální zkreslovače a (iv) přizpůsobení pro potenciální nenormálnost (asymetrii) dat pomocí jiných vhodných distribucí, jako je logaritmické normální nebo gama rozdělení. Bude provedena celková analýza dat ze studie in vitro.

   K odhadu a vyhodnocení mezí shody pro studie shody a spolehlivosti bude použita Bland-Altmanova analýza. Tam, kde je to vhodné, bude k odhadu a vyhodnocení příslušných koeficientů spolehlivosti použit smíšený modelový přístup.

   5.0 Klinický význam

   Pokud je pozorována souvislost mezi fenotypem Hp 2-2 s kardiovaskulárním rizikem, může být tato skupina pacientů zaměřena na léčbu vitaminem E vedle statinů a další konvenční léčbu ke snížení kardiovaskulárního rizika. Lze naplánovat budoucí rozsáhlou celostátní RCT, aby se zjistilo, zda léčba vitaminem E pomáhá snížit riziko u této skupiny pacientů. Provádění takových studií v multietnické populaci je nezbytné, protože poskytuje pohled na konzistenci a zobecnitelnost očekávaných přínosů.