凝血酶生成试验标准化方案的评估

主要目标 目的是通过使用精心设计的标准化协议并进一步提高 TGA-CAT（凝血酶生成测定校准的自动血栓图）方法的实验室间变异性，并进一步使大型前瞻性多中心研究成为现实。

该项目的目标是：

• 通过评估增强的标准化 TGA-CAT 协议来确定实验室间的变异性。
• 评估重度血友病 A 患者使用重组 FVIII 产品 (Advate) 是否会影响 TGA-CAT 方法的实验室间变异性
• 评估 TGA-CAT 方法的实验室间变异性是否受到严重血友病 A 患者施用长效 FVIII 产品（Adynovate）的影响
• 通过数据标准化来评估三种参考血浆的能力，以改善实验室之间的变异性。

简介 TGA CAT 方法已证明可用于多种用途，包括诊断和管理出血性疾病 (1, 2)、检测高凝状态 (3, 4) 以及监测和表征口服抗凝药物 (5, 6)。 这些研究大多是单中心研究，还需要大型前瞻性多中心研究进一步验证结果。 由于缺乏标准化的方法，这些多中心研究已被证明很难产生。 在过去的几年里，几篇文章通过提出彻底制定的标准化协议解决了 TGA-CAT 方法实验室间变异性大的问题。 重点已放在方法本身及其分析前因素以及参考血浆 (RP) 用于结果标准化的使用上。 一篇文章表明，选择 RP 进行结果标准化可以大大降低实验室间的变异性，并且某些 RP 具有更好的能力 (7)。

最近，一些半衰期延长的重组因子 VIII (rFVIII) 和 IX (rFIX) 药物已经开发出来，即将甚至已经上市。 药物延长活性的长度因患者而异，显然需要对患者的给药进行个体化调整。 凝血酶的生成可能被证明是一种极好的工具，可以为每个人量身定制最佳的药物管理和监测药物的效果。

方法和材料 凝血酶生成 将根据 Hemker 等人 (8) 描述的方法测量凝血酶生成：校准的自动血栓图（CAT，Thrombinoscope BV，马斯特里赫特，荷兰）。

试剂 PPP 试剂低 (1 pM)、PPP 试剂 (5 pM)、凝血酶校准器和 FluCa 试剂盒（TS31.00、 TS30.00, TS20.00 和 TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands) 将用于测试。

样品 将测试三种不同的血浆，正常血浆、低凝和高凝血浆。 将从 3 位供体收集正常和高凝血浆，从 4 位供体收集低凝血浆。 低凝血浆将从五名血友病 A (HA) 患者中收集，这些患者在 Malmö 凝血单元定期接受治疗，每次采集 10 支 4.5 mL 柠檬酸血液。 将从同一单位的 3 名同事采集正常血浆，每人捐献 13 管 4.5 mL 柠檬酸血液。 高凝血浆将从 3 名健康志愿者制备，通过取 13 管 4.5 mL 柠檬酸血液显示 TGA CAT 参数值 > 2 SD 中值。 来自一位严重 HA 患者的血浆也将在两个不同的场合进行 FVIII 浓缩物、Advate™ 和长效 Adynovate™ 的测试。 在知情同意后，患者将被要求在 72 小时内不要服用他的常规 proproxyxis 剂量。 患者将分别接受 30 U/kg 的 Advate™ 和 Adynovate™。 监测样品将在注射后 1 小时、8 小时、24 小时、36 小时和 48 小时（Advate™）和 1 小时、24 小时、36 小时、48 小时和 72 小时（Adynovate™）采集。 在每个时间点取 3 管 4.5 mL 血液。

参考血浆 Siemens Control Plasma P 稀释 1:5 将用作低凝 RP，HemosIL 校准血浆（Instrumentation Laboratory，Bedford，MA，USA）将用作标准 RP 和高凝血浆 PS-DP（蛋白 S 缺乏血浆） （酶研究实验室，美国印第安纳州南本德）将被使用。

统计分析原始数据将在马尔默斯科讷大学医院的凝血科进行收集和分析。 每个参与中心都将与 Malmö 凝血装置匹配，以进行协议测试，其中将使用 Bland-Altman 偏差图。 将计算每个中心的平均值、标准偏差 (SD) 和变异系数 (CV%)，并显示在表格中。 将绘制 Advate/Adynovate 消除曲线，并应用多变量重复测量方差分析（包括平行曲线的一般测试）来评估消除曲线中中心之间的差异。

研究设计 该研究旨在评估采用高度标准化方案进行 TGA 的 TGA-CAT 的实验室间变异性，使用 RF 对数据进行标准化对结果变异性的影响，以及评估 TGA-CAT 在监测长期监测中的有用性FVIII 给药。 参与中心的所有荧光计均应在研究开始前进行维修，并将温度校准至 37 C。 必须安装最新的软件版本（Thromboscope BV，荷兰马斯特里赫特，版本 V5.0.0.742）。 所有的实验室设备，移液器、水浴锅、净水器等，都需要校准。 研究所需的所有血浆、TGA-CAT 试剂将由马尔默的凝血中心管理并分发给所有参与中心。 包含板设置方案文件和涵盖关键分析前和分析步骤的视频文件的 USB 记忆棒也将与样品和试剂一起提供。 三个混合血浆（正常、低凝和高凝）、三个 RF、五个 Adynovate 和五个 Advate 监测样本将由每个参与中心在五天不同的时间内运行五次，按照 USB 记忆棒中提供的方案，使用两种不同的触发器、PPP 试剂低 (1 pM) 和 PPP 试剂 (5 pM)。 每天安排两次测试运行，以最大限度地利用 RF 和试剂。 测试三种不同类型的 RF 的原因是一个事实，即早期的研究结果表明在使用时可以更好地减少可变性，例如低凝 RF 到低凝血浆 (9)。