Valutazione di un protocollo standardizzato per il saggio di generazione della trombina

Obiettivo principale L'obiettivo è quello di migliorare ulteriormente la variabilità interlaboratorio per il metodo TGA-CAT (trombogramma automatizzato calibrato per la generazione di trombina) utilizzando un elaborato protocollo di standardizzazione e, in estensione, trasformando in realtà l'utilizzo di ampi studi prospettici multicentrici.

Obiettivi del progetto sono:

• Determinare la variabilità inter-laboratorio valutando un protocollo TGA-CAT standardizzato potenziato.
• Valutare se la variabilità interlaboratorio del metodo TGA-CAT è influenzata dalla somministrazione di un prodotto di FVIII ricombinante (Advate) in una persona con grave emofilia A
• Valutare se la variabilità interlaboratorio del metodo TGA-CAT è influenzata dalla somministrazione di un prodotto a base di FVIII a lunga durata d'azione (Adynovate) in una persona con grave emofilia A
• Valutare la capacità di tre plasma di riferimento, attraverso la normalizzazione dei dati, di migliorare la variabilità da laboratorio a laboratorio.

Introduzione Il metodo TGA CAT ha dimostrato la sua utilità per molteplici scopi tra cui la diagnosi e la gestione dei disturbi emorragici (1, 2), la rilevazione dell'ipercoagulabilità (3, 4) e il monitoraggio e la caratterizzazione dei farmaci anticoagulanti orali (5, 6). La maggior parte di questi studi sono studi monocentrici e sono necessari ampi studi multicentrici prospettici per convalidare ulteriormente i risultati. Questi studi multicentrici si sono dimostrati difficili da produrre a causa della mancanza di standardizzazione del metodo. Negli ultimi due anni diversi articoli hanno affrontato il problema della grande variabilità interlaboratorio per il metodo TGA-CAT presentando protocolli di standardizzazione accuratamente elaborati. L'attenzione è stata posta sia sul metodo stesso che sui suoi fattori pre-analitici, nonché sull'uso di plasmi di riferimento (RP) per la normalizzazione dei risultati. Un articolo ha mostrato che la scelta di RP per la normalizzazione dei risultati potrebbe ridurre notevolmente la variabilità interlaboratorio e che alcuni RP hanno una migliore capacità di farlo (7).

Ultimamente sono stati sviluppati numerosi farmaci ricombinanti a fattore VIII (rFVIII) e IX (rFIX) a emivita prolungata, che stanno per o addirittura hanno raggiunto il mercato. La durata dell'attività prolungata del farmaco varia da paziente a paziente ed è evidente la necessità di adattare individualmente la somministrazione del farmaco al paziente. La generazione di trombina potrebbe rivelarsi uno strumento eccellente per adattare la somministrazione ottimale del farmaco e monitorare l'effetto del farmaco per ogni individuo.

Metodi e materiali Generazione di trombina La generazione di trombina sarà misurata secondo il metodo descritto da Hemker et al. (8): trombogramma automatico calibrato (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Paesi Bassi).

Reagenti Reagente PPP LOW (1 pM), Reagente PPP (5 pM), Calibratore di trombina e kit FluCa (TS31.00, € 30,00, TS20.00 e TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Paesi Bassi) verrà utilizzato nel test.

Campioni Saranno testati tre diversi plasmi, plasma normale, plasma ipo e ipercoagulabile. Il plasma normale e ipercoagulabile sarà raccolto da 3 donatori e il plasma ipocoagulabile sarà raccolto da 4 donatori. Il plasma ipocoagulabile sarà raccolto da cinque pazienti con emofilia A (HA) regolarmente trattati presso l'unità di coagulazione di Malmö prelevando 10 provette da 4,5 ml di sangue citrato in un'unica occasione. Il plasma normale verrà prelevato da 3 collaboratori della stessa unità, ognuno dei quali donerà 13 provette da 4,5 ml di sangue citrato. Il plasma ipercoaguabile sarà preparato da 3 volontari sani, che hanno dimostrato di avere valori dei parametri TGA CAT >2 SD della mediana prendendo 13 provette da 4,5 mL di sangue citrato. Verrà testato anche il plasma di un paziente con HA grave a cui sono stati somministrati concentrati di FVIII, Advate™ o Adynovate™ a lunga durata d'azione in due diverse occasioni. Dopo il consenso informato al paziente verrà chiesto di non assumere la sua normale dose di profilassi per 72 ore. Al paziente verranno somministrati rispettivamente Advate™ e Adynovate™ a 30 U/kg. I campioni di monitoraggio verranno prelevati 1h, 8h, 24h, 36h e 48h (Advate™) e 1h, 24h, 36h, 48h e 72h (Adynovate™) dopo l'iniezione. Ad ogni punto temporale verranno prelevate 3 provette da 4,5 ml di sangue.

I plasmi di riferimento Siemens Control Plasma P diluito 1:5 saranno usati come RP ipocoaguabile, il plasma di calibrazione HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) sarà usato come RP standard e come plasma ipercoagulabile PS-DP (protein S-deficiency plasma) (Laboratori di ricerca sugli enzimi, South Bend, In, USA).

Analisi statistica I dati grezzi saranno raccolti e analizzati presso l'Unità di coagulazione, Skåne University Hospital, Malmö. Ogni centro partecipante sarà abbinato all'unità di coagulazione di Malmö in un test di concordanza in cui verrà utilizzato il diagramma di polarizzazione di Bland-Altman. La media, la deviazione standard (SD) e il coefficiente di variazione (CV%) saranno calcolati per ciascun centro con e senza normalizzazione e visualizzati in una tabella. Verranno tracciati i profili di eliminazione di Advate/Adynovate e verranno applicate analisi della varianza con misurazioni ripetute multivariate, incluso un test generale per curve parallele, per valutare le differenze tra i centri nei profili di eliminazione.

Disegno dello studio Lo studio si propone di valutare la variabilità inter-laboratorio di TGA-CAT eseguito con TGT con un protocollo altamente standardizzato, come l'uso di RF per la normalizzazione dei dati impatta sulla variabilità dei risultati e di valutare l'utilità di TGA-CAT nel monitoraggio prolungato Somministrazione del farmaco FVIII. Tutti i fluorometri dei centri partecipanti devono essere revisionati e avere la temperatura calibrata a 37 C prima dell'inizio dello studio. Deve essere installata la versione software più recente (Thromboscope BV, Maastricht, Paesi Bassi, versione V5.0.0.742). Tutte le apparecchiature di laboratorio, pipette, bagnomaria, depuratori d'acqua, ecc., devono essere calibrate. Tutti i plasmi, i reagenti TGA-CAT necessari per lo studio saranno somministrati e distribuiti a tutti i centri partecipanti dall'Unità di coagulazione, Malmö. Oltre ai campioni e ai reagenti, verrà fornita anche una chiavetta di memoria USB contenente un file dello schema di impostazione della piastra e un file video che copre le fasi pre-analitiche e analitiche critiche. Tre plasmi raggruppati (normale, ipo e ipercoaguabile), tre campioni di monitoraggio RF, cinque Adynovate e cinque Advate verranno analizzati cinque volte in cinque giorni diversi da ciascun centro partecipante, seguendo uno schema fornito nella chiavetta di memoria USB, con due diversi trigger, reagente PPP BASSO (1 pM) e reagente PPP (5 pM). Ogni giorno sono programmate due sessioni di test per massimizzare l'utilizzo di RF e reagenti. Il motivo per testare tre diversi tipi di RF è il fatto che i risultati di uno studio precedente implicavano una migliore riduzione della variabilità quando si utilizzava, ad esempio, un RF ipocoaguabile a plasma ipocoaguabile (9).