Оценка стандартизированного протокола анализа образования тромбина

Основная цель Цель состоит в дальнейшем улучшении межлабораторной вариабельности для метода TGA-CAT (автоматическая тромбограмма, калиброванная по анализу генерации тромбина) с использованием тщательно разработанного протокола стандартизации и, в более широком смысле, благодаря использованию крупных проспективных многоцентровых исследований.

Цели проекта:

• Определить межлабораторную изменчивость путем оценки расширенного стандартизированного протокола TGA-CAT.
• Оценить, влияет ли на межлабораторную изменчивость метода TGA-CAT введение рекомбинантного продукта FVIII (Advate) человеку с тяжелой формой гемофилии А.
• Оценить, влияет ли на межлабораторную изменчивость метода TGA-CAT введение продукта FVIII длительного действия (Adynovate) человеку с тяжелой формой гемофилии А.
• Оценить способность трех эталонных плазм путем нормализации данных улучшить межлабораторную изменчивость.

Введение Метод TGA CAT доказал свою полезность для многих целей, включая диагностику и лечение нарушений свертываемости крови (1, 2), выявление гиперкоагуляции (3, 4), а также мониторинг и характеристику пероральных антикоагулянтов (5, 6). Большинство этих исследований являются одноцентровыми, и для дальнейшего подтверждения результатов необходимы крупные проспективные многоцентровые исследования. Эти многоцентровые исследования оказались трудными для проведения из-за отсутствия стандартизации метода. За последние пару лет в нескольких статьях рассматривалась проблема большой межлабораторной изменчивости метода ТГА-КАТ путем представления тщательно разработанных протоколов стандартизации. Основное внимание уделялось как самому методу, так и его преаналитическим факторам, а также использованию эталонной плазмы (RP) для нормализации результатов. В одной статье было показано, что выбор RP для нормализации результатов может значительно уменьшить межлабораторную изменчивость и что некоторые RP лучше подходят для этого (7).

Недавно был разработан ряд рекомбинантных препаратов фактора VIII (rFVIII) и IX (rFIX) с длительным периодом полувыведения, которые вот-вот поступят на рынок или уже вышли на рынок. Продолжительность пролонгированного действия препарата различается у разных пациентов, и очевидна необходимость индивидуального подбора режима введения препарата пациенту. Генерация тромбина может оказаться отличным инструментом для подбора оптимального режима введения лекарств и мониторинга эффекта препарата для каждого человека.

Методы и материалы Генерация тромбина Генерация тромбина будет измеряться в соответствии с методом, описанным Hemker et al. (8): калиброванная автоматизированная тромбограмма (CAT, Thrombinoscope BV, Маастрихт, Нидерланды).

Реагенты PPP-реагент LOW (1 пМ), PPP-реагент (5 пМ), калибратор тромбина и FluCa-набор (TS31.00, ТС30.00, ТС20.00 и ТС50.00, В тесте будет использоваться Thrombinoscope BV, Маастрихт, Нидерланды).

Образцы Будут протестированы три разных плазмы: нормальная плазма, плазма с гипо- и гиперкоагуляцией. Нормальная и гиперкоагуляционная плазма будет собрана у 3 доноров, а гипокоагулянтная плазма будет собрана у 4 доноров. Гипокоагулянтная плазма будет собираться у пяти пациентов с гемофилией А (ГА), регулярно лечащихся в отделении коагуляции Мальмё, путем взятия 10 пробирок 4,5 мл цитратной крови за один раз. Обычная плазма будет собрана у 3 сотрудников в одном отделении, каждый из которых сдаст 13 пробирок с цитратной кровью объемом 4,5 мл. Гиперкоагулируемая плазма будет приготовлена ​​из 3 здоровых добровольцев, у которых показано, что значения параметра TGA CAT >2 SD медианы, путем взятия 13 пробирок с 4,5 мл цитратной крови. Также будет протестирована плазма одного пациента с тяжелой формой ГА, который получал концентраты FVIII, Advate™ или Adynovate™ длительного действия в двух отдельных случаях. После информированного согласия пациента попросят не принимать обычную профилактическую дозу в течение 72 часов. Пациенту будут давать Advate™ и Adynovate™ соответственно по 30 ЕД/кг. Образцы для мониторинга будут взяты через 1 час, 8 часов, 24 часа, 36 часов и 48 часов (Advate™) и 1 час, 24 часа, 36 часов, 48 часов и 72 часа (Adynovate™) после инъекции. В каждый момент времени будут взяты 3 пробирки с кровью по 4,5 мл.

Эталонная плазма Siemens Control Plasma P, разбавленная 1:5, будет использоваться в качестве гипокоагулируемой RP, калибровочная плазма HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) будет использоваться в качестве стандартной RP и в качестве гиперкоагуляционной плазмы PS-DP (плазма с дефицитом белка S). (Исследовательские лаборатории ферментов, Саут-Бенд, Индиана, США).

Статистический анализ Исходные данные будут собираться и анализироваться в отделении коагуляции университетской больницы Сконе, Мальмё. Каждый участвующий центр будет сопоставлен с коагуляционной установкой Malmö в тесте согласия, где будет использоваться график смещения Бланда-Альтмана. Среднее значение, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV%) будут рассчитаны для каждого центра с нормализацией и без нее и отображены в таблице. Профили элиминации Advate/Adynovate будут построены на графике, и для оценки различий между центрами в профилях элиминации будут применены многомерные повторные измерения дисперсионного анализа, включая общий тест на параллельные кривые.

Дизайн исследования Исследование направлено на оценку межлабораторной вариабельности ТГА-КТ, выполненной ТГТ с высокостандартизированным протоколом, на то, как использование РФ для нормализации данных влияет на вариабельность результатов, а также на оценку полезности ТГА-КТ при длительном мониторинге. Введение препарата FVIII. Все флуорометры участвующих центров должны быть обслужены и откалиброваны по температуре до 37°С до начала исследования. Должна быть установлена ​​последняя версия программного обеспечения (Thromboscope BV, Маастрихт, Нидерланды, версия V5.0.0.742). Все лабораторное оборудование, пипетки, водяные бани, водоочистители и т. д. необходимо калибровать. Вся плазма, реагенты TGA-CAT, необходимые для исследования, будут вводиться и распределяться во все участвующие центры Отделом коагуляции в Мальмё. Вместе с образцами и реагентами также будет предоставлен USB-накопитель, содержащий файл схемы установки планшета и видеофайл, описывающий важные преаналитические и аналитические этапы. Три объединенных образца плазмы (нормальный, гипо- и гиперкоагуляционный), три образца RF, пять образцов Adynovate и пять образцов Advate будут проанализированы пять раз в пять разных дней каждым участвующим центром в соответствии со схемой, приведенной на USB-накопителе, с двумя разными триггеры, ППП-реагент LOW (1 пМ) и ППП-реагент (5 пМ). Два тестовых прогона планируются каждый день, чтобы максимизировать использование РФ и реагентов. Причиной тестирования трех различных типов РФ является тот факт, что результаты более раннего исследования подразумевали лучшее снижение вариабельности при использовании, например, гипокоагуляционного РФ по сравнению с гипокоагуляционной плазмой (9).