Bewertung eines standardisierten Protokolls für den Thrombin-Generierungs-Assay

Hauptziel Ziel ist es, die Variabilität zwischen den Laboren für die TGA-CAT-Methode (Thrombin Generation Assay-Calibrated Automated Thrombogram) durch die Verwendung eines ausgefeilten Standardisierungsprotokolls weiter zu verbessern und in der Erweiterung den Einsatz großer prospektiver multizentrischer Studien Wirklichkeit werden zu lassen.

Ziele des Projekts sind:

• Bestimmung der Variabilität zwischen den Laboren durch Auswertung eines erweiterten standardisierten TGA-CAT-Protokolls.
• Bewertung, ob die Variabilität der TGA-CAT-Methode zwischen den Labors durch die Verabreichung eines rekombinanten FVIII-Produkts (Advate) bei einer Person mit schwerer Hämophilie A beeinflusst wird
• Es sollte bewertet werden, ob die Variabilität zwischen den Labors der TGA-CAT-Methode durch die Verabreichung eines langwirksamen FVIII-Produkts (Adynovate) bei einer Person mit schwerer Hämophilie A beeinflusst wird
• Bewertung der Fähigkeit von drei Referenzplasmen, durch Normalisierung der Daten die Variabilität von Labor zu Labor zu verbessern.

Einführung Die TGA-CAT-Methode hat sich für mehrere Zwecke als nützlich erwiesen, einschließlich der Diagnose und Behandlung von Blutgerinnungsstörungen (1, 2), der Erkennung von Hyperkoagulabilität (3, 4) und der Überwachung und Charakterisierung von oralen Antikoagulanzien (5, 6). Die meisten dieser Studien sind monozentrische Studien, und große prospektive multizentrische Studien sind erforderlich, um die Ergebnisse weiter zu validieren. Diese multizentrischen Studien haben sich aufgrund fehlender Standardisierung der Methode als schwer durchführbar erwiesen. In den letzten Jahren haben mehrere Artikel das Problem der großen Schwankungen zwischen den Labors für die TGA-CAT-Methode angesprochen, indem sie gründlich ausgearbeitete Standardisierungsprotokolle präsentierten. Der Fokus wurde sowohl auf die Methode selbst und ihre präanalytischen Faktoren als auch auf die Verwendung von Referenzplasmen (RP) zur Normalisierung der Ergebnisse gelegt. Ein Artikel zeigte, dass die Wahl von RP für die Normalisierung der Ergebnisse die Variabilität zwischen den Laboren stark reduzieren könnte und dass bestimmte RP dazu besser in der Lage sind (7).

In letzter Zeit wurde eine Reihe rekombinanter Faktor VIII (rFVIII)- und IX (rFIX)-Medikamente mit verlängerter Halbwertszeit entwickelt, die kurz vor der Markteinführung stehen oder diese bereits erreicht haben. Die Dauer der anhaltenden Wirkung des Arzneimittels ist von Patient zu Patient unterschiedlich, und es besteht ein Bedarf für eine individuelle Anpassung der Arzneimittelverabreichung an den Patienten. Die Thrombin-Erzeugung könnte sich als ein hervorragendes Instrument erweisen, um die optimale Arzneimittelverabreichung maßzuschneidern und die Wirkung des Arzneimittels für jeden Einzelnen zu überwachen.

Methoden und Materialien Thrombin-Erzeugung Die Thrombin-Erzeugung wird gemäß der von Hemker et al. (8) beschriebenen Methode gemessen: kalibriertes automatisiertes Thrombogramm (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Niederlande).

Reagenzien PPP-Reagenz LOW (1 pM), PPP-Reagenz (5 pM), Thrombin-Kalibrator und FluCa-Kit (TS31.00, TS30,00, TS20,00 und TS50,00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Niederlande) wird im Test verwendet.

Proben Drei verschiedene Plasmen werden getestet, normales Plasma, hypo- und hyperkoagulierbares Plasma. Normales und hyperkoagulierbares Plasma wird von 3 Spendern gepoolt und hypokoagulierbares Plasma wird von 4 Spendern gesammelt. Hypokoagulierbares Plasma wird von fünf Patienten mit Hämophilie A (HA), die regelmäßig in der Malmö-Koagulationseinheit behandelt werden, gewonnen, indem jeweils 10 4,5-ml-Röhrchen mit Citratblut entnommen werden. Normales Plasma wird von 3 Mitarbeitern in derselben Einheit gesammelt, wobei jede Person 13 Röhrchen mit 4,5 ml Zitratblut spendet. Hyperkoagulierbares Plasma wird von 3 gesunden Freiwilligen hergestellt, die TGA-CAT-Parameterwerte >2 SD des Medians aufweisen, indem 13 Röhrchen mit 4,5 ml Zitratblut entnommen werden. Plasma von einem Patienten mit schwerer HA, dem FVIII-Konzentrate, Advate™ bzw. das langwirksame Adynovate™ bei zwei verschiedenen Gelegenheiten verabreicht wurden, wird ebenfalls getestet. Nach Einverständniserklärung wird der Patient gebeten, seine reguläre Prophylaxe-Dosis 72 Stunden lang nicht einzunehmen. Der Patient erhält Advate™ bzw. Adynovate™ mit 30 E/kg. Die Überwachungsproben werden 1 h, 8 h, 24 h, 36 h und 48 h (Advate™) und 1 h, 24 h, 36 h, 48 h und 72 h (Adynovate™) nach der Injektion entnommen. Zu jedem Zeitpunkt werden 3 Röhrchen mit 4,5 ml Blut entnommen.

Referenzplasmen Siemens Kontrollplasma P 1:5 verdünnt wird als hypokoagulierbares RP verwendet, HemosIL Kalibrierungsplasma (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) wird als Standard RP und als hyperkoagulierbares Plasma PS-DP (Protein S-Mangelplasma) verwendet (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN, USA) verwendet werden.

Statistische Analyse Die Rohdaten werden in der Gerinnungsabteilung des Universitätskrankenhauses Skåne, Malmö, gesammelt und analysiert. Jedes teilnehmende Zentrum wird in einem Übereinstimmungstest, bei dem ein Bland-Altman-Bias-Plot verwendet wird, mit der Gerinnungseinheit Malmö abgeglichen. Mittelwert, Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient (CV%) werden für jedes Zentrum mit und ohne Normalisierung berechnet und in einer Tabelle angezeigt. Die Advate/Adynovate-Eliminierungsprofile werden aufgezeichnet und multivariate Varianzanalysen mit wiederholten Messungen, einschließlich eines allgemeinen Tests für parallele Kurven, werden angewendet, um die Unterschiede zwischen den Zentren in den Eliminierungsprofilen zu bewerten.

Studiendesign Die Studie zielt darauf ab, die Variabilität von TGA-CAT durchgeführter TGT zwischen den Labors mit einem hochgradig standardisierten Protokoll zu bewerten, wie sich die Verwendung von RFs zur Normalisierung von Daten auf die Variabilität der Ergebnisse auswirkt und die Nützlichkeit von TGA-CAT bei der verlängerten Überwachung zu bewerten FVIII-Medikamentenverabreichung. Alle Fluorometer der teilnehmenden Zentren sollten vor Beginn der Studie gewartet und auf 37 C temperaturkalibriert werden. Es muss die neueste Softwareversion installiert sein (Thromboscope BV, Maastricht, Niederlande, Version V5.0.0.742). Alle Laborgeräte, Pipetten, Wasserbäder, Wasseraufbereiter usw. müssen kalibriert werden. Alle für die Studie benötigten Plasmen und TGA-CAT-Reagenzien werden von der Gerinnungsabteilung, Malmö, verabreicht und an alle teilnehmenden Zentren verteilt. Neben den Proben und Reagenzien wird auch ein USB-Speicherstick mit einer Plattenaufbau-Schemadatei und einer Videodatei bereitgestellt, die wichtige präanalytische und analytische Schritte abdeckt. Drei gepoolte Plasmen (normal, hypo- und hyperkoagulierbar), drei RF-, fünf Adynovate- und fünf Advate-Überwachungsproben werden von jedem teilnehmenden Zentrum fünfmal an fünf verschiedenen Tagen nach einem auf dem USB-Speicherstick bereitgestellten Schema mit zwei unterschiedlichen Proben getestet Trigger, PPP-Reagenz NIEDRIG (1 Uhr) und PPP-Reagenz (5 Uhr). Jeden Tag sind zwei Testläufe geplant, um die Nutzung von HF und Reagenzien zu maximieren. Der Grund für das Testen von drei verschiedenen Arten von RF ist die Tatsache, dass frühere Studienergebnisse eine bessere Reduzierung der Variabilität bei der Verwendung von beispielsweise hypokoagulierbarem RF im Vergleich zu hypokoagulierbarem Plasma implizierten (9).