Evaluering af en standardiseret protokol for Thrombin Generation Assay

Hovedmål Målet er yderligere at forbedre inter-laboratorievariabiliteten for TGA-CAT-metoden (Thrombin generation assay-calibrated automated thrombogram) metoden ved at bruge en omfattende standardiseringsprotokol og i forlængelse heraf gøre brugen af ​​store prospektive multicenterstudier til virkelighed.

Projektets mål er:

• For at bestemme inter-laboratorievariabiliteten ved at evaluere en forbedret standardiseret TGA-CAT-protokol.
• For at vurdere, om TGA-CAT-metodens interlaboratorievariabilitet påvirkes ved administration af et rekombinant FVIII-produkt (Advate) hos en person med svær hæmofili A
• For at vurdere, om TGA-CAT-metodens interlaboratorievariabilitet påvirkes ved administration af et langtidsvirkende FVIII-produkt (Adynovate) hos en person med svær hæmofili A
• At evaluere tre referenceplasmas evne til, gennem normalisering af data, at forbedre lab-til-lab variabiliteten.

Introduktion TGA CAT-metoden har bevist sin anvendelighed til flere formål, herunder diagnosticering og håndtering af blødningsforstyrrelser (1, 2), påvisning af hyperkoagulabilitet (3, 4) og overvågning og karakterisering af orale antikoagulerende lægemidler (5, 6). De fleste af disse studier er enkeltcenterstudier, og store prospektive multicenterstudier er nødvendige for yderligere at validere resultaterne. Disse multicenterstudier har vist sig at være svære at fremstille på grund af manglende standardisering af metoden. I de sidste par år har adskillige artikler behandlet problemet med stor inter-laboratorievariabilitet for TGA-CAT metoden ved at præsentere gennemarbejdede standardiseringsprotokoller. Fokus er blevet sat både på selve metoden og dens præanalytiske faktorer samt brugen af ​​referenceplasmaer (RP) til normalisering af resultater. En artikel viste, at valget af RP til normalisering af resultater i høj grad kunne reducere inter-lab-variabiliteten, og at visse RP har en bedre evne til at gøre det (7).

På det seneste er der blevet udviklet en række rekombinante faktor VIII (rFVIII) og IX (rFIX) lægemidler med forlænget halveringstid, som er ved at eller endda er kommet på markedet. Længden af ​​lægemidlets forlængede aktivitet er forskellig fra patient til patient, og et behov for individuel tilpasning af patientens lægemiddeladministration er indlysende. Thrombingenerering kan vise sig at være et glimrende værktøj til at skræddersy den optimale lægemiddeladministration og overvåge lægemidlets virkning for hvert individ.

Metoder og materialer Thrombingenerering Thrombingenerering vil blive målt i henhold til metoden beskrevet af Hemker et al.(8): kalibreret automatiseret trombogram (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Holland).

Reagenser PPP-reagens LOW (1 pM), PPP-reagens (5 pM), Thrombin Calibrator og FluCa-kit (TS31.00, TS30.00, TS20.00 og TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Holland) vil blive brugt i testen.

Prøver Tre forskellige plasmaer vil blive testet, normalt plasma, hypo- og hyperkoagulerbart plasma. Normalt og hyperkoagulerbart plasma vil blive samlet fra 3 donorer, og hypokoagulerbart plasma vil blive opsamlet fra 4 donorer. Hypokoagulerbart plasma vil blive opsamlet fra fem hæmofili A (HA)-patienter, der regelmæssigt behandles på Malmøs koagulationsenhed ved at tage 10 4,5 ml rør med citratblod ved én lejlighed. Normalt plasma vil blive indsamlet fra 3 medarbejdere på samme enhed, hver person donerer 13 rør med 4,5 ml citratblod. Hyperkoaguerbart plasma vil blive fremstillet fra 3 raske frivillige, som har vist sig at have TGA CAT-parameterværdier >2 SD af median ved at tage 13 rør med 4,5 ml citratblod. Plasma fra én patient med svær HA-patient, som har fået FVIII-koncentrater, Advate™ henholdsvis det langtidsvirkende Adynovate™ ved to separate lejligheder vil også blive testet. Efter informeret samtykke vil patienten blive bedt om ikke at tage sin almindelige profylakse dosis i 72 timer. Patienten får henholdsvis Advate™ og Adynovate™ med 30 U/kg. Overvågningsprøverne tages 1 time, 8 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer (Advate™) og 1 timer, 24 timer, 36 timer, 48 timer og 72 timer (Adynovate™) efter injektion. På hvert tidspunkt tages 3 rør med 4,5 ml blod.

Referenceplasmaer Siemens Control Plasma P fortyndet 1:5 vil blive brugt som hypokoaguerbart RP, HemosIL kalibreringsplasma (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) vil blive brugt som standard RP og som hyperkoagulerbart plasma PS-DP (protein S-mangelplasma) (Enzymforskningslaboratorier, South Bend, In, USA) vil blive brugt.

Statistisk analyse Rådata vil blive indsamlet og analyseret på koagulationsenheden, Skånes Universitetshospital, Malmø. Hvert deltagende center vil blive matchet med Malmö Coagulation-enhed i en test af aftale, hvor Bland-Altman bias plot vil blive brugt. Middelværdien, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (CV%) vil blive beregnet for hvert center med og uden normalisering og vist i en tabel. Advate/Adynovate eliminationsprofilerne vil blive plottet, og multivariate gentagne målinger variansanalyser, herunder en generel test for parallelle kurver, vil blive anvendt til at evaluere forskelle mellem centrene i eliminationsprofilerne.

Undersøgelsesdesign Undersøgelsen har til formål at evaluere inter-laboratorievariabiliteten af ​​TGA-CAT udført TGT med en højt standardiseret protokol, hvordan brugen af ​​RF'er til normalisering af data påvirker variabiliteten af ​​resultater og at evaluere anvendeligheden af ​​TGA-CAT i langvarig overvågning FVIII lægemiddeladministration. Alle fluorometre på de deltagende centers skal serviceres og have en temperatur kalibreret til 37 C før start af undersøgelsen. Den seneste softwareversion skal være installeret (Thromboscope BV, Maastricht, Holland, version V5.0.0.742). Alt laboratorieudstyr, pipetter, vandbade, vandrensere osv. skal kalibreres. Alle plasmaer, TGA-CAT-reagenser, der er nødvendige for undersøgelsen, vil blive administreret og distribueret til alle deltagende centre af koagulationsenheden, Malmø. En USB-memory stick indeholdende en pladeopsætningsskemafil og en videofil, der dækker kritiske præanalytiske og analytiske trin, vil også blive leveret sammen med prøverne og reagenserne. Tre poolede plasmaer (normale, hypo- og hyperkoaguerbare), tre RF-, fem Adynovate- og fem Advate-monitoreringsprøver vil blive kørt fem gange på fem forskellige dage af hvert deltagende center, efter et skema, der findes i USB-memory stick'en, med to forskellige triggere, PPP-reagens LOW (1 pM) og PPP-reagens (5 pM). To testkørsler er planlagt hver dag for at maksimere RF- og reagensbrug. Årsagen til at teste tre forskellige typer af RF er det faktum, at tidligere undersøgelsesresultater indebar en bedre reduktion af variabilitet ved brug af f.eks. en hypokoaguerbar RF til hypokoaguerbare plasmaer (9).