Evaluatie van een gestandaardiseerd protocol voor trombinegeneratietest

Hoofddoel Het doel is om de interlaboratoriumvariabiliteit voor de TGA-CAT-methode (Thrombin Generation Assay-Calibrated Automated Thrombogram) verder te verbeteren door gebruik te maken van een uitgebreid standaardisatieprotocol en in het verlengde daarvan het gebruik van grote prospectieve multicenterstudies werkelijkheid te laten worden.

Doelen van het project zijn:

• De variabiliteit tussen laboratoria bepalen door een verbeterd gestandaardiseerd TGA-CAT-protocol te evalueren.
• Om te evalueren of de interlaboratoriumvariabiliteit van de TGA-CAT-methode wordt bewerkstelligd door toediening van een recombinant FVIII-product (Advaat) bij een persoon met ernstige hemofilie A
• Om te evalueren of de interlaboratoriumvariabiliteit van de TGA-CAT-methode wordt bewerkstelligd door toediening van een langwerkend FVIII-product (Adynovate) bij een persoon met ernstige hemofilie A
• Het vermogen van drie referentieplasma's evalueren, door normalisatie van gegevens, om de variabiliteit van laboratorium tot laboratorium te verbeteren.

Inleiding De TGA CAT-methode heeft zijn nut bewezen voor meerdere doeleinden, waaronder de diagnose en behandeling van bloedingsstoornissen (1, 2), het detecteren van hypercoagulabiliteit (3, 4) en het monitoren en karakteriseren van orale anticoagulantia (5, 6). De meeste van deze studies zijn single-center studies en grote prospectieve multi-center studies zijn nodig om de resultaten verder te valideren. Deze onderzoeken in meerdere centra zijn moeilijk te produceren gebleken vanwege een gebrek aan standaardisatie van de methode. In de afgelopen jaren hebben verschillende artikelen het probleem van de grote interlaboratoriumvariabiliteit voor de TGA-CAT-methode aangepakt door grondig uitgewerkte standaardisatieprotocollen te presenteren. Er is zowel aandacht besteed aan de methode zelf en de pre-analytische factoren als aan het gebruik van referentieplasma's (RP) voor het normaliseren van de resultaten. Een artikel toonde aan dat de keuze van RP voor het normaliseren van resultaten de variabiliteit tussen laboratoria aanzienlijk zou kunnen verminderen en dat bepaalde RP hiertoe beter in staat zijn (7).

De laatste tijd is een aantal recombinante factor VIII (rFVIII) en IX (rFIX) geneesmiddelen met verlengde halfwaardetijd ontwikkeld en deze staan ​​op het punt de markt te bereiken of zijn zelfs op de markt gekomen. De duur van de langdurige activiteit van het medicijn verschilt per patiënt en er is duidelijk behoefte aan individuele afstemming van de medicijntoediening door de patiënt. Het genereren van trombine zou een uitstekend hulpmiddel kunnen blijken te zijn bij het afstemmen van de optimale medicijntoediening en het monitoren van het effect van het medicijn voor elk individu.

Methoden en materialen Trombineproductie De trombineproductie zal worden gemeten volgens de methode beschreven door Hemker et al.(8): gekalibreerd geautomatiseerd trombogram (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nederland).

Reagentia PPP-reagens LOW (1 pM), PPP-reagens (5 pM), trombinekalibrator en FluCa-kit (TS31.00, TS30.00, TS20.00 en TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nederland) zal worden gebruikt in de test.

Monsters Er zullen drie verschillende plasma's worden getest, normaal plasma, hypo- en hypercoaguleerbaar plasma. Normaal en hypercoaguleerbaar plasma wordt verzameld van 3 donoren en hypocoaguleerbaar plasma wordt verzameld van 4 donoren. Hypocoaguleerbaar plasma zal worden verzameld van vijf hemofilie A (HA)-patiënten die regelmatig worden behandeld in de Malmö-coagulatie-eenheid door in één keer 10 buisjes van 4,5 ml gecitreerd bloed te nemen. Normaal plasma wordt verzameld bij 3 collega's op dezelfde afdeling, waarbij elke persoon 13 buisjes met 4,5 ml gecitreerd bloed doneert. Hypercoaguleerbaar plasma zal worden bereid uit 3 gezonde vrijwilligers, waarvan is aangetoond dat ze TGA CAT-parameterwaarden > 2 SD van de mediaan hebben door 13 buisjes met 4,5 ml gecitreerd bloed te nemen. Plasma van één patiënt met ernstige HA-patiënt die FVIII-concentraten, Advate™ respectievelijk het langwerkende Adynovate™ op twee verschillende momenten heeft gekregen, zal ook worden getest. Na geïnformeerde toestemming zal de patiënt worden gevraagd om zijn normale profylaxedosis gedurende 72 uur niet in te nemen. De patiënt krijgt respectievelijk Advate™ en Adynovate™ in een dosis van 30 E/kg. De controlemonsters worden 1 uur, 8 uur, 24 uur, 36 uur en 48 uur (Advate™) en 1 uur, 24 uur, 36 uur, 48 uur en 72 uur (Adynovate™) na injectie genomen. Op elk tijdstip worden 3 buisjes met 4,5 ml bloed afgenomen.

Referentieplasma's Siemens Control Plasma P 1:5 verdund zal worden gebruikt als hypocoageerbaar RP, HemosIL-kalibratieplasma (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, VS) zal worden gebruikt als standaard RP en als hypercoageerbaar plasma PS-DP (proteïne S-deficiëntieplasma) (Enzyme research laboratories, South Bend, In, VS) zal worden gebruikt.

Statistische analyse Ruwe gegevens zullen worden verzameld en geanalyseerd op de Coagulation Unit, Skåne University Hospital, Malmö. Elk deelnemend centrum zal worden gekoppeld aan de Malmö-coagulatie-eenheid in een test van overeenstemming waarbij de Bland-Altman-bias-plot zal worden gebruikt. Het gemiddelde, de standaarddeviatie (SD) en de variatiecoëfficiënt (CV%) worden voor elk centrum met en zonder normalisatie berekend en weergegeven in een tabel. De Advate/Adynovate-eliminatieprofielen zullen worden geplot en multivariate herhaalde metingen van variantieanalyses, inclusief een algemene test voor parallelle krommen, zullen worden toegepast om verschillen tussen centra in de eliminatieprofielen te evalueren.

Onderzoeksopzet Het onderzoek heeft tot doel de interlaboratoriumvariabiliteit van met TGA-CAT uitgevoerde TGT met een sterk gestandaardiseerd protocol te evalueren, hoe het gebruik van RF's voor normalisatie van gegevens van invloed is op de variabiliteit van resultaten en om het nut van TGA-CAT bij langdurige monitoring te evalueren. FVIII medicijntoediening. Alle Fluorometers van de deelnemende centra moeten worden onderhouden en de temperatuur moet worden gekalibreerd op 37 C voordat het onderzoek begint. De nieuwste softwareversie moet geïnstalleerd zijn (Thromboscope BV, Maastricht, Nederland, versie V5.0.0.742). Alle laboratoriumapparatuur, pipetten, waterbaden, waterzuiveraars, enz. moeten worden gekalibreerd. Alle plasma's en TGA-CAT-reagentia die nodig zijn voor het onderzoek zullen worden toegediend en gedistribueerd naar alle deelnemende centra door de Coagulation Unit, Malmö. Naast de monsters en reagentia wordt ook een USB-geheugenstick geleverd met een plaatopstellingsschema en een videobestand met kritieke pre-analytische en analytische stappen. Drie gepoolde plasma's (normaal, hypo- en hypercoaguabel), drie RF-, vijf Adynovate- en vijf Advate-monitoringmonsters zullen vijf keer op vijf verschillende dagen worden uitgevoerd door elk deelnemend centrum, volgens een schema op de USB-geheugenstick, met twee verschillende triggers, PPP-reagens LAAG (13.00 uur) en PPP-reagens (17.00 uur). Er worden elke dag twee testruns gepland om het gebruik van RF en reagens te maximaliseren. De reden voor het testen van drie verschillende typen RF is het feit dat eerdere onderzoeksresultaten een betere reductie van de variabiliteit impliceerden bij het gebruik van bijvoorbeeld hypocoaguabele RF voor hypocoaguabele plasma's (9).