Trombiinin muodostumismäärityksen standardoidun protokollan arviointi

Päätavoite Tavoitteena on edelleen parantaa TGA-CAT (Thrombin Generation Assay-calibrated automated thrombogram) -menetelmän laboratorioiden välistä vaihtelua käyttämällä pitkälle kehitettyä standardisointiprotokollaa ja laajennuksessa mahdollistaen suurten prospektiivisten monikeskustutkimusten käytön.

Hankkeen tavoitteet ovat:

• Laboratorioiden välisen vaihtelun määrittäminen arvioimalla parannettua standardoitua TGA-CAT-protokollaa.
• Arvioida, vaikuttaako TGA-CAT-menetelmän laboratorioiden välinen vaihtelu antamalla yhdistelmä-FVIII-tuotetta (Advate) henkilölle, jolla on vaikea hemofilia A
• Arvioida, vaikuttaako TGA-CAT-menetelmän laboratorioiden välinen vaihtelu pitkävaikutteisen FVIII-tuotteen (Adynovate) antaminen henkilölle, jolla on vaikea hemofilia A
• Arvioida kolmen vertailuplasman kykyä parantaa laboratorioiden välistä vaihtelua tietojen normalisoinnin avulla.

Johdanto TGA CAT -menetelmä on osoittautunut hyödylliseksi useisiin tarkoituksiin, mukaan lukien verenvuotohäiriöiden diagnosointi ja hoito (1, 2), hyperkoagulaation havaitseminen (3, 4) sekä oraalisten antikoagulanttien seuranta ja karakterisointi (5, 6). Suurin osa näistä tutkimuksista on yhden keskuksen tutkimuksia, ja tulosten vahvistamiseksi tarvitaan laajoja prospektiivisia monikeskustutkimuksia. Nämä monikeskustutkimukset ovat osoittautuneet vaikeiksi toteuttaa menetelmän standardoinnin puutteen vuoksi. Parin viime vuoden aikana useissa artikkeleissa on käsitelty TGA-CAT-menetelmän suuren laboratorioiden välisen vaihtelun ongelmaa esittämällä perusteellisesti kehitettyjä standardointiprotokollia. Painopiste on ollut sekä itse menetelmässä että sen esianalyyttisissa tekijöissä sekä vertailuplasmojen (RP) käytössä tulosten normalisoinnissa. Yksi artikkeli osoitti, että RP:n valinta tulosten normalisoimiseksi voisi vähentää suuresti laboratorioiden välistä vaihtelua ja että tietyillä RP:llä on parempi kyky tehdä niin (7).

Viime aikoina on kehitetty useita rekombinantteja tekijä VIII (rFVIII) ja IX (rFIX) lääkkeitä, joilla on pidentynyt puoliintumisaika, ja ne ovat tulossa tai jopa saapuneet markkinoille. Lääkkeen pitkittyneen vaikutuksen pituus vaihtelee potilaiden välillä ja tarve räätälöidä potilaan lääkkeenanto yksilöllisesti on ilmeinen. Trombiinin muodostuminen voi osoittautua erinomaiseksi työkaluksi räätälöidä optimaalinen lääkeannos ja seurata lääkkeen vaikutusta jokaiselle yksilölle.

Menetelmät ja materiaalit Trombiinin muodostuminen Trombiinin muodostuminen mitataan Hemkerin et al.(8) kuvaaman menetelmän mukaisesti: kalibroitu automatisoitu trombogrammi (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Alankomaat).

Reagenssit PPP-reagenssi LOW (1 pM), PPP-reagenssi (5 pM), trombiinikalibraattori ja FluCa-kit (TS31.00, TS30,00, TS20.00 ja TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Alankomaat) käytetään testissä.

Näytteet Testataan kolme erilaista plasmaa, normaali plasma, hypo- ja hyperkoaguloituva plasma. Normaali ja hyperkoaguloituva plasma yhdistetään 3 luovuttajalta ja hypokoaguloituva plasma kerätään 4 luovuttajalta. Hypokoaguloituvaa plasmaa kerätään viideltä hemofilia A (HA) -potilaalta, joita hoidetaan säännöllisesti Malmön koagulaatioyksikössä, ottamalla kerralla 10 4,5 ml:n putkea sitroitua verta. Normaali plasma kerätään kolmelta työtoverilta samassa yksikössä, ja jokainen luovuttaa 13 putkea 4,5 ml sitraattiverta. Hyperkoaguloituva plasma valmistetaan kolmesta terveestä vapaaehtoisesta, joiden TGA CAT -parametriarvojen osoitetaan olevan > 2 SD mediaanista ottamalla 13 putkea 4,5 ml sitroitua verta. Plasma yhdeltä vaikeaa HA-potilaalta sairastavalta potilaalta, jolle on annettu FVIII-konsentraatteja, Advate™ tai vastaavasti pitkävaikutteinen Adynovate™ kahdessa eri yhteydessä, testataan. Tietoisen suostumuksen jälkeen potilasta pyydetään olemaan ottamatta säännöllistä profylaksiannosta 72 tuntiin. Potilaalle annetaan Advate™- ja ​​Adynovate™-valmistetta 30 U/kg. Tarkkailunäytteet otetaan 1 h, 8 h, 24 h, 36 h ja 48 h (Advate™) ja 1 h, 24 h, 36 h, 48 h ja 72 h (Adynovate™) injektion jälkeen. Joka ajankohtana otetaan 3 putkea 4,5 ml verta.

Vertailuplasmat Siemens Control Plasma P laimennettuna 1:5 käytetään hypokoaguloituvana RP:nä, HemosIL-kalibrointiplasmaa (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) käytetään normaalina RP:nä ja hyperkoaguloituvana plasmana PS-DP (proteiini S-deficiency plasma) (Entsyymitutkimuslaboratoriot, South Bend, In, USA) käytetään.

Tilastollinen analyysi Raakadataa kerätään ja analysoidaan Malmön Skånen yliopistollisen sairaalan koagulaatioyksikössä. Jokainen osallistuva keskus yhdistetään Malmö Coagulation -yksikön kanssa sopimustestissä, jossa käytetään Bland-Altmanin harhakuvaa. Keskiarvo, keskihajonta (SD) ja variaatiokerroin (CV%) lasketaan kullekin keskukselle normalisoituneena ja ilman ja esitetään taulukossa. Advate/Adynovate-eliminaatioprofiilit piirretään ja usean muuttujan toistuvien mittausten varianssianalyysejä, mukaan lukien rinnakkaisten käyrien yleinen testi, sovelletaan eliminaatioprofiilien keskipisteiden välisten erojen arvioimiseen.

Tutkimuksen suunnittelu Tutkimuksen tavoitteena on arvioida TGA-CAT:n suorittaman TGT:n laboratorioiden välistä vaihtelua pitkälle standardoidulla protokollalla, kuinka radiotaajuuksien käyttö datan normalisoimiseksi vaikuttaa tulosten vaihteluun ja arvioida TGA-CAT:n hyödyllisyyttä pitkäaikaisen seurannassa. FVIII-lääkkeen antaminen. Kaikki osallistujakeskuksen fluorometrit tulee huoltaa ja niiden lämpötila on kalibroitu 37 C:een ennen tutkimuksen aloittamista. Uusin ohjelmistoversio on asennettava (Thromboscope BV, Maastricht, Alankomaat, versio V5.0.0.742). Kaikki laboratoriolaitteet, pipetit, vesihauteet, vedenpuhdistimet jne. on kalibroitava. Kaikki tutkimukseen tarvittavat plasmat ja TGA-CAT-reagenssit annostelee ja jakaa kaikkiin osallistuviin keskuksiin Malmön koagulaatioyksikön toimesta. Näytteiden ja reagenssien rinnalle toimitetaan myös USB-muistitikku, joka sisältää levyn asennuskaaviotiedoston ja videotiedoston, joka kattaa kriittiset esianalyysi- ja analyyttiset vaiheet. Kukin osallistuva keskus suorittaa kolme yhdistettyä plasmaa (normaali, hypo- ja hyperkoaguloituva), kolme RF-, viisi Adynovate- ja viisi Advate-monitorointinäytettä viisi kertaa viitenä eri päivänä USB-muistitikussa olevan järjestelmän mukaisesti kahdella eri tavalla. laukaisimia, PPP-reagenssi LOW (1 pM) ja PPP-reagenssi (5 pM). Joka päivä suunnitellaan kaksi testiajoa radiotaajuuden ja reagenssin käytön maksimoimiseksi. Syy kolmen eri tyyppisen RF:n testaamiseen on se tosiasia, että aikaisemmat tutkimustulokset viittasivat parempaan vaihtelun vähenemiseen käytettäessä esimerkiksi hypokoaguloituvaa RF:ää hypokoaguloituvaan plasmaan (9).