A trombingenerációs vizsgálat szabványosított protokolljának értékelése

Fő cél A cél a TGA-CAT (Thrombin Generation assay-calibrated automated thrombogram) módszer laboratóriumok közötti variabilitásának továbbfejlesztése egy kidolgozott szabványosítási protokoll segítségével, és kiterjesztve a nagy prospektív, többközpontú vizsgálatok alkalmazását.

A projekt céljai a következők:

• A laboratóriumok közötti variabilitás meghatározása továbbfejlesztett szabványosított TGA-CAT protokoll értékelésével.
• Annak értékelése, hogy a TGA-CAT módszer laboratóriumok közötti variabilitását befolyásolja-e egy rekombináns FVIII termék (Advate) beadása súlyos hemofíliában A.
• Annak értékelése, hogy a TGA-CAT módszer laboratóriumok közötti variabilitását befolyásolja-e egy hosszú hatású FVIII termék (Adynovate) beadása súlyos hemofíliás A-ban szenvedő betegeknél.
• Három referenciaplazma azon képességének értékelése, hogy az adatok normalizálása révén javítsa a laboratóriumok közötti variabilitást.

Bevezetés A TGA CAT módszer több célra is hasznosnak bizonyult, ideértve a vérzési rendellenességek diagnosztizálását és kezelését (1, 2), a hiperkoagulálhatóság kimutatását (3, 4), valamint az orális antikoagulánsok monitorozását és jellemzését (5, 6). A legtöbb ilyen tanulmány egyközpontú vizsgálat, és nagy prospektív, többközpontú vizsgálatokra van szükség az eredmények további validálásához. Ezeket a többközpontú tanulmányokat nehéznek bizonyult elkészíteni a módszer szabványosításának hiánya miatt. Az elmúlt néhány évben számos cikk foglalkozott a TGA-CAT módszer nagy laboratóriumok közötti variabilitásának problémájával, alaposan kidolgozott szabványosítási protokollok bemutatásával. A hangsúly mind magára a módszerre, mind annak preanalitikai tényezőire, valamint a referenciaplazmák (RP) használatára került az eredmények normalizálására. Egy cikk kimutatta, hogy az RP választása az eredmények normalizálására nagymértékben csökkentheti a laboratóriumok közötti variabilitást, és bizonyos RP-k jobbak erre (7).

Az utóbbi időben számos, megnyújtott felezési idejű rekombináns VIII-as faktor (rFVIII) és IX-es (rFIX) gyógyszert fejlesztettek ki, amelyek hamarosan piacra kerültek, vagy már megjelentek. A gyógyszer elhúzódó hatásának időtartama betegenként eltérő, és nyilvánvaló, hogy szükség van a beteg gyógyszeradagolásának egyéni testreszabására. A trombin generálás kiváló eszköznek bizonyulhat az optimális gyógyszeradagolás személyre szabásában és a gyógyszer hatásának nyomon követésében.

Módszerek és anyagok Trombinképződés A trombinképződés mérése a Hemker és munkatársai (8) által leírt módszer szerint történik: kalibrált automatizált trombográfia (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Hollandia).

Reagensek PPP-reagens LOW (1 pM), PPP-reagens (5 pM), trombinkalibrátor és FluCa-kit (TS31.00, TS30,00, TS20.00 és TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Hollandia) fogják használni a tesztet.

Minták Három különböző plazmát vizsgálunk meg, normál plazmát, hipo- és hiperkoagulálható plazmát. A normál és hiperkoagulálható plazmát 3 donortól, a hipokoagulálható plazmát pedig 4 donortól gyűjtik össze. Öt, a malmöi véralvadási osztályon rendszeresen kezelt hemofíliás A (HA) betegtől hipokoagulálható plazmát gyűjtenek 10 db 4,5 ml-es citrátos vérből egy alkalommal. Normál plazmát gyűjtenek 3 munkatárstól ugyanabban az egységben, minden személy 13 tubus 4,5 ml-es citrát vért ad. Hiperkoagulálható plazmát készítenek 3 egészséges önkéntesből, akikről kimutatták, hogy a TGA CAT-paraméterek értéke > 2 SD medián, 13 cső 4,5 ml-es citrátos vér felvételével. Egy olyan súlyos HA-ban szenvedő beteg plazmáját is megvizsgálják, aki FVIII-koncentrátumot, Advate™-t, illetve hosszú hatástartamú Adynovate™-ot kapott két külön alkalommal. A tájékozott beleegyezés után a pácienst arra kérik, hogy 72 órán keresztül ne vegye be a szokásos profilaxis adagját. A beteg Advate™-t, illetve Adynovate™-ot kap 30 E/kg mennyiségben. A megfigyelő mintákat 1 órával, 8 órával, 24 órával, 36 órával és 48 órával (Advate™), valamint 1 órával, 24 órával, 36 órával, 48 órával és 72 órával (Adynovate™) veszik az injekció beadása után. Minden időpontban 3 cső 4,5 ml-es vért vesznek.

Referenciaplazmák Az 1:5 arányban hígított Siemens Control Plasma P-t hipokoagulálható RP-ként, a HemosIL-kalibrációs plazmát (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) használják standard RP-ként és hiperkoagulálható plazma PS-DP-ként (protein S-deficiency plasma). (Enzimkutató laboratóriumok, South Bend, In, USA) fogják használni.

Statisztikai elemzés A nyers adatokat a malmöi Skåne Egyetemi Kórház koagulációs osztályán gyűjtik és elemzik. Minden résztvevő központot a Malmö Coagulation egységgel egyeztetnek a megállapodás tesztjén, ahol a Bland-Altman torzítási területet használják. Az átlagot, a szórást (SD) és a variációs együtthatót (CV%) a rendszer minden központra kiszámítja normalizálással és anélkül, és táblázatban jeleníti meg. Az Advate/Adynovate eliminációs profilokat ábrázolják, és többváltozós ismételt mérési varianciaanalízist alkalmaznak, beleértve a párhuzamos görbék általános tesztjét is, hogy kiértékeljék az eliminációs profilok középpontjai közötti különbségeket.

A vizsgálat felépítése A tanulmány célja, hogy értékelje a TGA-CAT által végzett TGT laboratóriumok közötti variabilitását egy erősen szabványosított protokollal, hogy az RF-ek használata az adatok normalizálására hogyan befolyásolja az eredmények változékonyságát, valamint hogy értékelje a TGA-CAT hasznosságát a hosszú távú monitorozásban. FVIII gyógyszerbeadás. A részt vevő központ minden fluorométerét szervizelni kell, és a hőmérsékletet 37 C-ra kell kalibrálni a vizsgálat megkezdése előtt. A legújabb szoftververziót kell telepíteni (Thromboscope BV, Maastricht, Hollandia, V5.0.0.742 verzió). Minden laboratóriumi berendezést, pipettát, vízfürdőt, víztisztítót stb. kalibrálni kell. A vizsgálathoz szükséges összes plazmát és TGA-CAT reagenst a malmöi koagulációs osztály fogja beadni és elosztani az összes résztvevő központba. A minták és a reagensek mellett egy USB-memóriakártya is rendelkezésre áll, amely egy lemezbeállítási sémafájlt és egy videófájlt tartalmaz, amely lefedi a kritikus analitikai és analitikai lépéseket. Három egyesített plazmát (normál, hipo- és hiperkoagulálható), három rádiófrekvenciás, öt Adynovate és öt Advate megfigyelő mintát ötször, öt különböző napon futtatnak le minden résztvevő központ, az USB-memóriakártyán található séma szerint, két különböző módszerrel. triggerek, PPP-reagens LOW (1 pM) és PPP-reagens (5 pM). A rádiófrekvenciás és a reagenshasználat maximalizálása érdekében minden nap két tesztet ütemeznek be. A három különböző típusú RF tesztelésének oka az a tény, hogy egy korábbi vizsgálati eredmények azt sugallták, hogy a variabilitás jobban csökken, ha például hipokoagulálható rádiófrekvenciát alkalmaznak hipokoagulálható plazmákra (9).