Vyhodnocení standardizovaného protokolu pro test generování trombinu

Hlavní cíl Cílem je dále zlepšovat mezilaboratorní variabilitu pro metodu TGA-CAT (Thrombin generation assay-calibrated automatizovaný trombogram) pomocí propracovaného standardizačního protokolu a v širším měřítku realizovat využití velkých prospektivních multicentrických studií.

Cíle projektu jsou:

• Stanovit mezilaboratorní variabilitu vyhodnocením rozšířeného standardizovaného protokolu TGA-CAT.
• Vyhodnotit, zda je mezilaboratorní variabilita metody TGA-CAT ovlivněna podáním rekombinantního FVIII produktu (Advate) u osoby s těžkou hemofilií A
• Vyhodnotit, zda je mezilaboratorní variabilita metody TGA-CAT ovlivněna podáním dlouhodobě působícího přípravku FVIII (Adynovate) u osoby s těžkou hemofilií A
• Vyhodnotit schopnost tří referenčních plazmat prostřednictvím normalizace dat zlepšit variabilitu mezi laboratořemi.

Úvod Metoda TGA CAT prokázala svou užitečnost pro různé účely včetně diagnostiky a léčby poruch krvácení (1, 2), detekce hyperkoagulability (3, 4) a sledování a charakterizace perorálních antikoagulancií (5, 6). Většina těchto studií jsou jednocentrické a k dalšímu ověření výsledků jsou potřeba velké prospektivní multicentrické studie. Ukázalo se, že tyto multicentrické studie jsou obtížně proveditelné kvůli nedostatečné standardizaci metody. V posledních několika letech se několik článků zabývalo problémem velké mezilaboratorní variability pro metodu TGA-CAT předložením důkladně propracovaných standardizačních protokolů. Důraz byl kladen jak na samotnou metodu a její preanalytické faktory, tak na využití referenčních plazmat (RP) pro normalizaci výsledků. Jeden článek ukázal, že volba RP pro normalizaci výsledků by mohla výrazně snížit variabilitu mezi laboratořemi a že některé RP mají lepší schopnost toho dosáhnout (7).

V poslední době byla vyvinuta řada léků s rekombinantním faktorem VIII (rFVIII) a IX (rFIX) s prodlouženým poločasem rozpadu, které se chystají na trh nebo se dokonce dostaly na trh. Délka dlouhodobého působení léku se u pacientů liší a je zřejmá potřeba individuálního přizpůsobení podávání léku pacientovi. Generování trombinu by se mohlo ukázat jako vynikající nástroj pro přizpůsobení optimálního podávání léku a sledování účinku léku pro každého jednotlivce.

Metody a materiály Generování trombinu Generace trombinu bude měřena podle metody popsané Hemkerem et al.(8): kalibrovaný automatizovaný trombogram (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nizozemí).

Reagencie PPP-reagent LOW (1 pM), PPP-reagent (5 pM), trombinový kalibrátor a FluCa-kit (TS31.00, 30,00 TS, TS20,00 a TS50,00, V testu bude použit Thrombinoscope BV, Maastricht, Nizozemsko).

Vzorky Budou testovány tři různé plazmy, normální plazma, hypo- a hyperkoagulační plazma. Normální a hyperkoagulační plazma bude shromážděna od 3 dárců a hypokoagulační plazma bude odebrána od 4 dárců. Hypokoagulační plazma bude odebrána pěti pacientům s hemofilií A (HA) pravidelně léčeným na koagulační jednotce v Malmö odebráním 10 4,5 ml zkumavek citrátové krve najednou. Normální plazma bude odebrána 3 spolupracovníkům na stejné jednotce, přičemž každá osoba daruje 13 zkumavek 4,5 ml citrátové krve. Hyperkoagulovatelná plazma bude připravena od 3 zdravých dobrovolníků, u kterých bylo prokázáno, že mají hodnoty parametru TGA CAT >2 SD mediánu odebráním 13 zkumavek 4,5 ml citrátové krve. Bude také testována plazma od jednoho pacienta s těžkou HA, kterému byly podávány koncentráty FVIII, Advate™ respektive dlouhodobě působící Adynovate™ při dvou různých příležitostech. Po informovaném souhlasu bude pacient požádán, aby po dobu 72 hodin neužíval svou běžnou profylaxi dávku. Pacientovi bude podán Advate™ a Adynovate™ v dávce 30 U/kg. Monitorovací vzorky budou odebírány 1 hodinu, 8 hodin, 24 hodin, 36 hodin a 48 hodin (Advate™) a 1 hodinu, 24 hodin, 36 hodin, 48 hodin a 72 hodin (Adynovate™) po injekci. V každém časovém bodě budou odebrány 3 zkumavky po 4,5 ml krve.

Referenční plazma Siemens Control Plasma P naředěná 1:5 bude použita jako hypokoagulovatelná RP, kalibrační plazma HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) bude použita jako Standardní RP a jako hyperkoagulovatelná plazma PS-DP (plazma s deficitem proteinu S) (Enzyme research Laboratories, South Bend, In, USA).

Statistická analýza Nezpracovaná data budou shromažďována a analyzována na koagulační jednotce, Skåne University Hospital, Malmö. Každé zúčastněné centrum bude porovnáno s koagulační jednotkou Malmö v testu shody, kde bude použit Bland-Altmanův diagram zkreslení. Průměr, směrodatná odchylka (SD) a variační koeficient (CV %) budou vypočteny pro každé centrum s normalizací a bez normalizace a zobrazeny v tabulce. Budou vyneseny profily eliminace Advate/Adynovate a k vyhodnocení rozdílů mezi centry v profilech eliminace budou použity multivariační opakované měření analýzy rozptylu včetně obecného testu pro paralelní křivky.

Design studie Cílem studie je zhodnotit mezilaboratorní variabilitu TGA-CAT prováděného TGT s vysoce standardizovaným protokolem, jak použití RFs pro normalizaci dat ovlivňuje variabilitu výsledků a zhodnotit užitečnost TGA-CAT při monitorování prodloužených Podávání léku FVIII. Všechny fluorometry zúčastněných center by měly být před zahájením studie servisovány a měly by mít teplotu kalibrovanou na 37 C. Musí být nainstalována nejnovější verze softwaru (Thromboscope BV, Maastricht, Nizozemsko, verze V5.0.0.742). Veškeré laboratorní vybavení, pipety, vodní lázně, čističky vody atd. je třeba kalibrovat. Všechny plazmy a reagencie TGA-CAT potřebné pro studii budou podávány a distribuovány do všech zúčastněných center koagulační jednotkou, Malmö. Spolu se vzorky a činidly bude také poskytnuta USB paměťová karta obsahující soubor schématu nastavení destičky a video soubor pokrývající kritické preanalytické a analytické kroky. Tři spojené plazmy (normální, hypo- a hyperkoagulovatelné), tři RF, pět monitorovacích vzorků Adynovate a pět monitorovacích vzorků Advate bude v každém zúčastněném centru pětkrát v pěti různých dnech, podle schématu poskytnutého na USB paměti, se dvěma různými spouštěče, PPP-reagent LOW (1 pM) a PPP-reagent (5 pM). Každý den jsou naplánovány dva testovací běhy, aby se maximalizovalo využití RF a reagencií. Důvodem pro testování tří různých typů RF je skutečnost, že výsledky dřívější studie naznačovaly lepší snížení variability při použití např. hypokoagulovatelné RF na hypokoagulační plazmu (9).