Evaluering av en standardisert protokoll for trombingenerasjonsanalyse

Hovedmål Målet er å ytterligere forbedre inter-laboratorievariabiliteten for TGA-CAT (Thrombin generation assay-calibrated automated thrombogram) metoden ved å bruke en forseggjort standardiseringsprotokoll og i forlengelsen gjøre bruken av store prospektive multisenterstudier til en realitet.

Mål for prosjektet er:

• For å bestemme inter-laboratorievariabiliteten ved å evaluere en forbedret standardisert TGA-CAT-protokoll.
• For å evaluere om den interlaboratoriske variasjonen til TGA-CAT-metoden påvirkes ved administrering av et rekombinant FVIII-produkt (Advate) hos en person med alvorlig hemofili A
• For å evaluere om inter-laboratorievariasjonen til TGA-CAT-metoden påvirkes ved administrering av et langtidsvirkende FVIII-produkt (Adynovate) hos en person med alvorlig hemofili A
• Å evaluere tre referanseplasmas evne, gjennom normalisering av data, til å forbedre lab-til-lab-variabiliteten.

Introduksjon TGA CAT-metoden har bevist sin nytte for flere formål, inkludert diagnostisering og behandling av blødningsforstyrrelser (1, 2), påvisning av hyperkoagulabilitet (3, 4) og overvåking og karakterisering av orale antikoagulasjonsmedisiner (5, 6). De fleste av disse studiene er enkeltsenterstudier og store prospektive multisenterstudier er nødvendige for å validere resultatene ytterligere. Disse multisenterstudiene har vist seg å være vanskelige å produsere på grunn av manglende standardisering av metoden. I løpet av de siste par årene har flere artikler tatt for seg problemet med stor inter-laboratorievariabilitet for TGA-CAT-metoden ved å presentere grundig utarbeidede standardiseringsprotokoller. Fokus har blitt satt både på selve metoden og dens pre-analytiske faktorer samt bruk av referanseplasma (RP) for normalisering av resultater. En artikkel viste at valg av RP for normalisering av resultater i stor grad kunne redusere interlab-variabiliteten og at enkelte RP har bedre evne til å gjøre det (7).

I det siste har en rekke rekombinante faktor VIII (rFVIII) og IX (rFIX) legemidler med forlenget halveringstid blitt utviklet og er i ferd med å eller har nådd markedet. Lengden på medikamentets langvarige aktivitet er forskjellig mellom pasientene, og et behov for individuell skreddersøm av pasientens legemiddeladministrering er åpenbart. Trombingenerering kan vise seg å være et utmerket verktøy for å skreddersy optimal legemiddeladministrering og overvåke effekten av legemidlet for hvert individ.

Metoder og materialer Trombingenerering Trombingenerering vil bli målt i henhold til metoden beskrevet av Hemker et al.(8): kalibrert automatisert trombogram (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nederland).

Reagenser PPP-reagens LAV (1 pM), PPP-reagens (5 pM), trombinkalibrator og FluCa-sett (TS31.00, TS30.00, TS20.00 og TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nederland) vil bli brukt i testen.

Prøver Tre forskjellige plasmaer vil bli testet, normalt plasma, hypo- og hyperkoagulerbart plasma. Normalt og hyperkoagulerbart plasma vil bli samlet fra 3 givere og hypokoagulerbart plasma vil bli samlet fra 4 givere. Hypokoagulerbart plasma vil bli samlet inn fra fem hemofili A (HA) pasienter som regelmessig behandles ved Malmö koagulasjonsenhet ved å ta 10 4,5 ml rør med sitratblod ved en anledning. Normal plasma vil bli samlet inn fra 3 medarbeidere ved samme enhet, hver person donerer 13 rør med 4,5 ml citratblod. Hyperkoaguerbart plasma vil bli tilberedt fra 3 friske frivillige, som har vist seg å ha TGA CAT-parameterverdier >2 SD av median ved å ta 13 rør med 4,5 mL citratblod. Plasma fra en pasient med alvorlig HA-pasient som har fått FVIII-konsentrater, Advate™ henholdsvis det langtidsvirkende Adynovate™ ved to separate anledninger vil også bli testet. Etter informert samtykke vil pasienten bli bedt om å ikke ta den vanlige profylaksedosen på 72 timer. Pasienten vil bli gitt Advate™ og Adynovate™ med henholdsvis 30 U/kg. Overvåkingsprøvene vil bli tatt 1 time, 8 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer (Advate™) og 1 timer, 24 timer, 36 timer, 48 timer og 72 timer (Adynovate™) etter injeksjon. På hvert tidspunkt tas 3 rør med 4,5 ml blod.

Referanseplasmaer Siemens Control Plasma P fortynnet 1:5 vil bli brukt som hypokoaguerbart RP, HemosIL kalibreringsplasma (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) vil bli brukt som standard RP og som hyperkoagulerbart plasma PS-DP (protein S-mangelplasma) (Enzyme research laboratories, South Bend, In, USA) vil bli brukt.

Statistisk analyse Rådata vil bli samlet inn og analysert ved Koagulasjonsenheten, Skånes universitetssykehus, Malmö. Hvert deltakende senter vil bli matchet med Malmö koagulasjonsenhet i en test av avtale hvor Bland-Altman bias plot vil bli brukt. Gjennomsnitt, standardavvik (SD) og variasjonskoeffisient (CV%) vil bli beregnet for hvert senter med og uten normalisering og vist i en tabell. Advate/Adynovate-eliminasjonsprofilene vil bli plottet og multivariate gjentatte målingsanalyser av varians inkludert en generell test for parallelle kurver, vil bli brukt for å evaluere forskjeller mellom sentre i eliminasjonsprofilene.

Studiedesign Studien tar sikte på å evaluere interlaboratorievariabiliteten til TGA-CAT utført TGT med en høyt standardisert protokoll, hvordan bruken av RF-er for normalisering av data påvirker variabiliteten av resultater og å evaluere nytten av TGA-CAT ved overvåking forlenget FVIII medikamentadministrasjon. Alle fluorometre på deltakende senter bør ha service og temperatur kalibrert til 37 C før studiestart. Den nyeste programvareversjonen må være installert (Thromboscope BV, Maastricht, Nederland, versjon V5.0.0.742). Alt laboratorieutstyr, pipetter, vannbad, vannrensere osv. må kalibreres. Alle plasmaer, TGA-CAT-reagenser som trengs for studien vil bli administrert og distribuert til alle deltakende sentre av koagulasjonsenheten, Malmö. En USB-minnepinne som inneholder en plateoppsettskjemafil og en videofil som dekker kritiske pre-analytiske og analytiske trinn, vil også bli gitt sammen med prøvene og reagensene. Tre sammenslåtte plasmaer (normale, hypo- og hyperkoaguerbare), tre RF-, fem Adynovate- og fem Advate-overvåkingsprøver vil bli kjørt fem ganger på fem forskjellige dager av hvert deltakende senter, etter et opplegg gitt i USB-minnepinnen, med to forskjellige triggere, PPP-reagens LOW (1 pM) og PPP-reagens (5 pM). To testkjøringer er planlagt hver dag for å maksimere RF- og reagensbruken. Grunnen til å teste tre forskjellige typer RF er at tidligere studieresultater antydet en bedre reduksjon av variabilitet ved bruk av, for eksempel en hypokoaguerbar RF til hypokoaguerbare plasmaer (9).