Avaliação de um protocolo padronizado para ensaio de geração de trombina

Objetivo principal O objetivo é melhorar ainda mais a variabilidade interlaboratorial do método TGA-CAT (trombograma automatizado calibrado por ensaio de geração de trombina) usando um protocolo de padronização elaborado e, em extensão, tornando realidade o uso de grandes estudos multicêntricos prospectivos.

Objetivos do projeto são:

• Determinar a variabilidade interlaboratorial avaliando um protocolo TGA-CAT padronizado aprimorado.
• Avaliar se a variabilidade interlaboratorial do método TGA-CAT é afetada pela administração de um produto FVIII recombinante (Advate) em uma pessoa com hemofilia A grave
• Avaliar se a variabilidade interlaboratorial do método TGA-CAT é afetada pela administração de um produto FVIII de ação prolongada (Adynovate) em uma pessoa com hemofilia A grave
• Avaliar a capacidade de três plasmas de referência, através da normalização dos dados, melhorar a variabilidade laboratório-laboratório.

Introdução O método TGA CAT provou sua utilidade para múltiplos propósitos, incluindo diagnóstico e tratamento de distúrbios hemorrágicos (1, 2), detecção de hipercoagulabilidade (3, 4) e monitoramento e caracterização de drogas anticoagulantes orais (5, 6). A maioria desses estudos são estudos de centro único e grandes estudos multicêntricos prospectivos são necessários para validar ainda mais os resultados. Esses estudos multicêntricos têm se mostrado difíceis de produzir devido à falta de padronização do método. Nos últimos anos, vários artigos abordaram o problema da grande variabilidade interlaboratorial para o método TGA-CAT, apresentando protocolos de padronização minuciosamente elaborados. O foco foi colocado tanto no método em si quanto em seus fatores pré-analíticos, bem como no uso de plasmas de referência (RP) para normalização dos resultados. Um artigo mostrou que a escolha de RP para a normalização dos resultados poderia reduzir muito a variabilidade interlaboratorial e que alguns RP têm uma melhor capacidade de fazê-lo (7).

Recentemente, vários medicamentos recombinantes de Fator VIII (rFVIII) e IX (rFIX) com meia-vida prolongada foram desenvolvidos e estão prestes a chegar ou já chegaram ao mercado. A duração da atividade prolongada do fármaco difere entre os pacientes e é óbvia a necessidade de adaptação individual da administração do fármaco ao paciente. A geração de trombina pode ser uma excelente ferramenta para adaptar a administração ideal de medicamentos e monitorar o efeito do medicamento para cada indivíduo.

Métodos e materiais Geração de trombina A geração de trombina será medida de acordo com o método descrito por Hemker et al.(8): trombograma automatizado calibrado (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda).

Reagentes Reagente PPP LOW (1 pM), Reagente PPP (5 pM), Calibrador de Trombina e FluCa-kit (TS31.00, TS30,00, TS20.00 e TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Holanda) será usado no teste.

Amostras Serão testados três plasmas diferentes, plasma normal, plasma hipo e hipercoagulável. O plasma normal e hipercoagulável será coletado de 3 doadores e o plasma hipocoagulável será coletado de 4 doadores. O plasma hipocoagulável será coletado de cinco pacientes com hemofilia A (HA) regularmente tratados na Unidade de Coagulação de Malmö, coletando 10 tubos de 4,5 mL de sangue citratado em uma ocasião. O plasma normal será coletado de 3 colaboradores da mesma unidade, cada pessoa doando 13 tubos de 4,5 mL de sangue citratado. O plasma hipercoagulável será preparado a partir de 3 voluntários saudáveis, apresentando valores de parâmetro TGA CAT > 2 DP da mediana, tomando 13 tubos de 4,5 mL de sangue citratado. O plasma de um paciente com HA grave que recebeu concentrados de FVIII, Advate™, respectivamente, o Adynovate™ de ação prolongada em duas ocasiões separadas também será testado. Após o consentimento informado, o paciente será solicitado a não tomar sua dose profilaxia regular por 72 horas. O paciente receberá Advate™ e Adynovate™ respectivamente a 30 U/kg. As amostras de monitoramento serão coletadas 1h, 8h, 24h, 36h e 48h (Advate™) e 1h, 24h, 36h, 48h e 72h (Adynovate™) após a injeção. Em cada ponto de tempo serão retirados 3 tubos de 4,5 mL de sangue.

Plasmas de referência Siemens Control Plasma P diluído 1:5 será usado como RP hipocoagulável, plasma de calibração HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, EUA) será usado como RP padrão e como plasma hipercoagulável PS-DP (plasma com deficiência de proteína S) (Laboratórios de pesquisa de enzimas, South Bend, In, EUA).

Análise estatística Os dados brutos serão coletados e analisados ​​na Unidade de Coagulação, Skåne University Hospital, Malmö. Cada centro participante será pareado com a unidade de Coagulação de Malmö em um teste de concordância em que o gráfico de viés de Bland-Altman será usado. A média, desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV%) serão calculados para cada centro com e sem normalização e apresentados em tabela. Os perfis de eliminação Advate/Adynovate serão plotados e análises multivariadas de medições repetidas de variância, incluindo um teste geral para curvas paralelas, serão aplicadas para avaliar as diferenças entre os Centros nos perfis de eliminação.

Desenho do estudo O estudo visa avaliar a variabilidade interlaboratorial de TGA-CAT realizado TGT com um protocolo altamente padronizado, como o uso de RFs para normalização de dados impacta na variabilidade de resultados e avaliar a utilidade de TGA-CAT no monitoramento prolongado Administração de drogas FVIII. Todos os fluorômetros dos centros participantes devem passar por manutenção e ter a temperatura calibrada para 37 C antes do início do estudo. A versão mais recente do software deve ser instalada (Thromboscope BV, Maastricht, Holanda, versão V5.0.0.742). Todos os equipamentos de laboratório, pipetas, banhos-maria, purificadores de água, etc., precisam ser calibrados. Todos os plasmas, reagentes TGA-CAT necessários para o estudo serão administrados e distribuídos a todos os centros participantes pela Unidade de Coagulação, Malmö. Um stick de memória USB contendo um arquivo de esquema de configuração de placa e um arquivo de vídeo cobrindo as etapas pré-analíticas e analíticas críticas também serão fornecidos junto com as amostras e reagentes. Três pools de plasmas (normal, hipo e hipercoaguláveis), três RF, cinco Adynovate e cinco amostras de monitoramento Advate serão executados cinco vezes em cinco dias diferentes por cada centro participante, seguindo um esquema fornecido no cartão de memória USB, com dois diferentes gatilhos, reagente PPP BAIXO (1 pM) e reagente PPP (5 pM). Duas execuções de teste são agendadas a cada dia para maximizar o uso de RF e reagentes. A razão para testar três tipos diferentes de RF é o fato de que os resultados de um estudo anterior implicaram em uma melhor redução da variabilidade ao usar, por exemplo, um RF hipocoagulável para plasmas hipocoaguláveis ​​(9).