Ocena znormalizowanego protokołu dla testu generacji trombiny

Główny cel Celem jest dalsza poprawa zmienności międzylaboratoryjnej dla metody TGA-CAT (zautomatyzowanego trombogramu kalibrowanego testem generacji trombiny) poprzez zastosowanie skomplikowanego protokołu standaryzacji, a co za tym idzie, urzeczywistnienie wykorzystania dużych prospektywnych badań wieloośrodkowych.

Cele projektu to:

• Określenie zmienności międzylaboratoryjnej poprzez ocenę rozszerzonego, znormalizowanego protokołu TGA-CAT.
• Ocena, czy zmienność międzylaboratoryjna metody TGA-CAT jest spowodowana podaniem rekombinowanego produktu FVIII (Advate) osobie z ciężką postacią hemofilii A
• Ocena, czy zmienność międzylaboratoryjna metody TGA-CAT jest spowodowana podaniem długo działającego produktu FVIII (Adynovate) osobie z ciężką hemofilią A
• Aby ocenić zdolność trzech osoczy referencyjnych, poprzez normalizację danych, do poprawy zmienności między laboratoriami.

Wprowadzenie Metoda TGA CAT dowiodła swojej przydatności w wielu celach, w tym w diagnostyce i leczeniu skaz krwotocznych (1, 2), wykrywaniu nadkrzepliwości (3, 4) oraz monitorowaniu i charakterystyce doustnych leków przeciwzakrzepowych (5, 6). Większość z tych badań to badania jednoośrodkowe i potrzebne są duże prospektywne badania wieloośrodkowe w celu dalszej walidacji wyników. Te wieloośrodkowe badania okazały się trudne do przeprowadzenia ze względu na brak standaryzacji metody. W ciągu ostatnich kilku lat kilka artykułów poruszało problem dużej zmienności międzylaboratoryjnej dla metody TGA-CAT, przedstawiając dokładnie opracowane protokoły standaryzacyjne. Skoncentrowano się zarówno na samej metodzie i jej czynnikach przedanalitycznych, jak i wykorzystaniu osocza referencyjnego (RP) do normalizacji wyników. Jeden artykuł wykazał, że wybór RP do normalizacji wyników może znacznie zmniejszyć zmienność między laboratoriami i że niektóre RP mają lepszą zdolność do tego (7).

Ostatnio opracowano wiele rekombinowanych leków na czynnik VIII (rFVIII) i IX (rFIX) o przedłużonym okresie półtrwania, które są już wkrótce lub nawet wejdą na rynek. Długość przedłużonego działania leku jest różna u poszczególnych pacjentów i oczywista jest potrzeba indywidualnego dostosowania dawkowania leku przez pacjenta. Generowanie trombiny może okazać się doskonałym narzędziem w dostosowaniu optymalnego podawania leku i monitorowaniu działania leku dla każdej osoby.

Metody i materiały Wytwarzanie trombiny Wytwarzanie trombiny będzie mierzone zgodnie z metodą opisaną przez Hemkera i wsp.(8): skalibrowany automatyczny trombogram (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Holandia).

Odczynniki Odczynnik PPP LOW (1 pM), odczynnik PPP (5 pM), kalibrator trombiny i zestaw FluCa (TS31.00, TS30,00, TS20.00 i TS50.00, W teście zostanie użyty Thrombinoscope BV, Maastricht, Holandia).

Próbki Zostaną zbadane trzy różne osocza: normalne osocze oraz osocze z hipo- i nadkrzepliwością. Osocze normalne i hiperkoagulujące zostanie zebrane od 3 dawców, a osocze hipokoagulacyjne zostanie pobrane od 4 dawców. Osocze hipokoagulacyjne zostanie pobrane od pięciu pacjentów z hemofilią A (HA), regularnie leczonych w Malmö Coagulation Unit, poprzez jednokrotne pobranie 10 probówek o pojemności 4,5 ml z cytrynianową krwią. Normalne osocze zostanie pobrane od 3 współpracowników z tego samego oddziału, a każda osoba odda 13 probówek z krwią cytrynianową o pojemności 4,5 ml. Nadkrzepliwe osocze zostanie przygotowane od 3 zdrowych ochotników, u których wykazano wartości parametrów TGA CAT >2 SD mediany, pobierając 13 probówek 4,5 ml krwi cytrynianowej. Osocze od jednego pacjenta z ciężkim HA, któremu podano koncentraty czynnika VIII, Advate™ lub długo działający Adynovate™ przy dwóch różnych okazjach, również zostanie przetestowane. Po wyrażeniu świadomej zgody pacjent zostanie poproszony o nieprzyjmowanie zwykłej dawki profilaktycznej przez 72 godziny. Pacjent otrzyma odpowiednio Advate™ i Adynovate™ w dawce 30 U/kg. Próbki monitorujące zostaną pobrane 1h, 8h, 24h, 36h i 48h (Advate™) oraz 1h, 24h, 36h, 48h i 72h (Adynovate™) po wstrzyknięciu. W każdym punkcie czasowym zostaną pobrane 3 probówki po 4,5 ml krwi.

Osocze referencyjne Siemens Control Plasma P rozcieńczone w stosunku 1:5 zostanie użyte jako hipokoagulujące RP, osocze kalibracyjne HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) zostanie użyte jako standardowe RP i jako hiperkoagowalne osocze PS-DP (osocze z niedoborem białka S) (Laboratoria badawcze enzymów, South Bend, In, USA).

Analiza statystyczna Surowe dane zostaną zebrane i przeanalizowane w Oddziale Koagulacji Szpitala Uniwersyteckiego Skåne w Malmö. Każdy uczestniczący ośrodek zostanie dopasowany do jednostki Malmö Coagulation w teście zgodności, w którym wykorzystany zostanie wykres odchylenia Blanda-Altmana. Średnia, odchylenie standardowe (SD) i współczynnik zmienności (CV%) zostaną obliczone dla każdego ośrodka z normalizacją i bez normalizacji i wyświetlone w tabeli. Profile eliminacji Advate/Adynovate zostaną wykreślone, a analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami wieloczynnikowymi, w tym ogólny test krzywych równoległych, zostaną zastosowane do oceny różnic między ośrodkami w profilach eliminacji.

Projekt badania Badanie ma na celu ocenę zmienności międzylaboratoryjnej TGA-CAT wykonanej TGT z wysoce wystandaryzowanym protokołem, wpływu zastosowania RF do normalizacji danych na zmienność wyników oraz ocenę przydatności TGA-CAT w monitorowaniu przedłużonego Podawanie leku FVIII. Wszystkie fluorometry ośrodka uczestniczącego powinny być serwisowane i skalibrowane do temperatury 37 C przed rozpoczęciem badania. Należy zainstalować najnowszą wersję oprogramowania (Thromboscope BV, Maastricht, Holandia, wersja V5.0.0.742). Cały sprzęt laboratoryjny, pipety, łaźnie wodne, oczyszczacze wody itp. wymagają kalibracji. Wszystkie osocza i odczynniki TGA-CAT potrzebne do badania będą podawane i dystrybuowane do wszystkich uczestniczących ośrodków przez Oddział Koagulacji w Malmö. Wraz z próbkami i odczynnikami zostanie również dostarczona pamięć USB zawierająca plik ze schematem przygotowania płytki oraz plik wideo przedstawiający najważniejsze etapy przedanalityczne i analityczne. Trzy zbiorcze próbki osocza (normalne, hipo- i nadkrzepliwe), trzy próbki monitorujące RF, pięć Adynovate i pięć próbek Advate będą analizowane pięć razy w pięć różnych dni przez każdy uczestniczący ośrodek, zgodnie ze schematem dostarczonym w pamięci USB, z dwoma różnymi wyzwalacze, odczynnik PPP NISKI (1 pm) i odczynnik PPP (5 pm). Każdego dnia zaplanowane są dwa przebiegi testowe, aby zmaksymalizować wykorzystanie RF i odczynników. Powodem testowania trzech różnych typów RF jest fakt, że wcześniejsze wyniki badań sugerowały lepszą redukcję zmienności przy stosowaniu, na przykład, hipokoagulacji RF do osocza hipokoaguowalnego (9).