Utvärdering av ett standardiserat protokoll för analys av trombingenerering

Huvudmål Målet är att ytterligare förbättra interlaboratorievariabiliteten för TGA-CAT-metoden (Thrombin generation assay-calibrated automated thrombogram)-metoden genom att använda ett utarbetat standardiseringsprotokoll och i förlängningen göra användningen av stora prospektiva multicenterstudier till verklighet.

Målen med projektet är:

• För att bestämma variationen mellan laboratorier genom att utvärdera ett förbättrat standardiserat TGA-CAT-protokoll.
• För att utvärdera om interlaboratorievariabiliteten hos TGA-CAT-metoden påverkas av administrering av en rekombinant FVIII-produkt (Advate) till en person med svår hemofili A
• För att utvärdera om TGA-CAT-metodens interlaboratorievariabilitet påverkas av administrering av en långverkande FVIII-produkt (Adynovate) hos en person med svår hemofili A
• Att utvärdera tre referensplasmas förmåga, genom normalisering av data, att förbättra labb-till-lab-variabiliteten.

Inledning TGA CAT-metoden har visat sin användbarhet för flera ändamål, inklusive diagnos och hantering av blödningsrubbningar (1, 2), detektering av hyperkoagulabilitet (3, 4) och övervakning och karakterisering av orala antikoagulantia (5, 6). De flesta av dessa studier är encenterstudier och stora prospektiva multicenterstudier behövs för att ytterligare validera resultaten. Dessa multicenterstudier har visat sig vara svåra att ta fram på grund av bristande standardisering av metoden. Under de senaste åren har flera artiklar tagit upp problemet med stor interlaboratorievariabilitet för TGA-CAT-metoden genom att presentera noggrant utarbetade standardiseringsprotokoll. Fokus har lagts både på själva metoden och dess preanalytiska faktorer samt användningen av referensplasma (RP) för normalisering av resultat. En artikel visade att valet av RP för normalisering av resultat avsevärt skulle kunna minska interlab-variabiliteten och att vissa RP har bättre förmåga att göra det (7).

På senare tid har ett antal rekombinanta faktor VIII (rFVIII) och IX (rFIX) läkemedel med förlängd halveringstid utvecklats och är på väg att eller till och med ha nått marknaden. Längden på läkemedlets långvariga aktivitet skiljer sig mellan patienter och ett behov av individuell anpassning av patientens läkemedelsadministrering är uppenbart. Trombingenerering kan visa sig vara ett utmärkt verktyg för att skräddarsy den optimala läkemedelsadministrationen och övervaka läkemedlets effekt för varje individ.

Metoder och material Trombingenerering Trombingenerering kommer att mätas enligt den metod som beskrivs av Hemker et al.(8): kalibrerat automatiserat trombogram (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nederländerna).

Reagenser PPP-reagens LÅG (1 pM), PPP-reagens (5 pM), trombinkalibrator och FluCa-kit (TS31.00, TS30.00, TS20.00 och TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Nederländerna) kommer att användas i testet.

Prover Tre olika plasma kommer att testas, normal plasma, hypo- och hyperkoagulerbar plasma. Normal och hyperkoagulerbar plasma kommer att slås samman från 3 givare och hypokoagulerbar plasma kommer att samlas in från 4 givare. Hypokoagulerbar plasma kommer att samlas in från fem hemofili A (HA) patienter som regelbundet behandlas på Malmö koagulationsenhet genom att vid ett tillfälle ta 10 stycken 4,5 ml rör med citratblod. Normal plasma kommer att samlas in från 3 medarbetare på samma enhet, där varje person donerar 13 rör med 4,5 ml citratblod. Hyperkoaguerbar plasma kommer att beredas från 3 friska frivilliga, som har visat sig ha TGA CAT-parametervärden >2 SD av medianen genom att ta 13 rör med 4,5 ml citratblod. Plasma från en patient med svår HA-patient som har fått FVIII-koncentrat, Advate™ respektive långverkande Adynovate™ vid två separata tillfällen kommer också att testas. Efter informerat samtycke kommer patienten att uppmanas att inte ta sin vanliga profylaxdos på 72 timmar. Patienten kommer att ges Advate™ respektive Adynovate™ med 30 U/kg. Övervakningsproverna kommer att tas 1h, 8h, 24h, 36h och 48h (Advate™) och 1h, 24h, 36h, 48h och 72h (Adynovate™) efter injektion. Vid varje tidpunkt tas 3 rör med 4,5 ml blod.

Referensplasma Siemens Control Plasma P utspädd 1:5 kommer att användas som hypokoaguerbar RP, HemosIL kalibreringsplasma (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) kommer att användas som standard RP och som hyperkoagulerbar plasma PS-DP (protein S-bristplasma) (Enzymforskningslaboratorier, South Bend, In, USA) kommer att användas.

Statistisk analys Rådata kommer att samlas in och analyseras vid Koagulationsenheten, Skånes Universitetssjukhus, Malmö. Varje deltagande center kommer att matchas med Malmö koagulationsenhet i ett avtalstest där Bland-Altman bias plot kommer att användas. Medelvärdet, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) kommer att beräknas för varje centrum med och utan normalisering och visas i en tabell. Advate/Adynovate-elimineringsprofilerna kommer att plottas och multivariata upprepade mätningar variansanalyser inklusive ett allmänt test för parallella kurvor kommer att tillämpas för att utvärdera skillnader mellan centra i elimineringsprofilerna.

Studiedesign Studien syftar till att utvärdera interlaboratorievariabiliteten hos TGA-CAT utförd TGT med ett högt standardiserat protokoll, hur användningen av RF:er för normalisering av data påverkar variabiliteten av resultat och att utvärdera användbarheten av TGA-CAT vid övervakning av långvarig övervakning. FVIII läkemedelsadministration. Alla fluorometrar på de deltagande centren bör servas och ha en temperatur kalibrerad till 37 C innan studien påbörjas. Den senaste mjukvaruversionen måste vara installerad (Thromboscope BV, Maastricht, Nederländerna, version V5.0.0.742). All laboratorieutrustning, pipetter, vattenbad, vattenrenare etc. behöver kalibreras. Alla plasma, TGA-CAT-reagens som behövs för studien kommer att administreras och distribueras till alla deltagande centra av koagulationsenheten, Malmö. Ett USB-minne som innehåller en fil för plattsättningsschema och en videofil som täcker kritiska föranalytiska och analytiska steg kommer också att tillhandahållas tillsammans med proverna och reagensen. Tre poolade plasma (normala, hypo- och hyperkoaguerbara), tre RF-, fem Adynovate- och fem Advate-övervakningsprover kommer att köras fem gånger på fem olika dagar av varje deltagande center, enligt ett schema som tillhandahålls i USB-minnet, med två olika triggers, PPP-reagens LOW (1 pM) och PPP-reagens (5 pM). Två testkörningar schemaläggs varje dag för att maximera RF- och reagensanvändningen. Anledningen till att testa tre olika typer av RF är att ett tidigare studieresultat antydde en bättre minskning av variabiliteten vid användning av till exempel en hypokoaguerbar RF till hypokoaguerbara plasma (9).