Évaluation d'un protocole standardisé pour le test de génération de thrombine

Objectif principal L'objectif est d'améliorer encore la variabilité inter-laboratoires pour la méthode TGA-CAT (Thrombin generation assay-calided automatic thrombogram) en utilisant un protocole de standardisation élaboré et en extension en faisant de l'utilisation de grandes études prospectives multicentriques une réalité.

Les objectifs du projet sont :

• Déterminer la variabilité inter-laboratoires en évaluant un protocole TGA-CAT standardisé amélioré.
• Évaluer si la variabilité inter-laboratoires de la méthode TGA-CAT est effectuée par l'administration d'un produit FVIII recombinant (Advate) chez une personne atteinte d'hémophilie A sévère
• Évaluer si la variabilité inter-laboratoires de la méthode TGA-CAT est affectée par l'administration d'un produit FVIII à action prolongée (Adynovate) chez une personne atteinte d'hémophilie A sévère
• Évaluer la capacité de trois plasmas de référence, grâce à la normalisation des données, à améliorer la variabilité d'un laboratoire à l'autre.

Introduction La méthode TGA CAT a prouvé son utilité à de multiples fins, notamment le diagnostic et la gestion des troubles hémorragiques (1, 2), la détection de l'hyper coagulabilité (3, 4) et la surveillance et la caractérisation des anticoagulants oraux (5, 6). La plupart de ces études sont des études monocentriques et de grandes études prospectives multicentriques sont nécessaires pour valider davantage les résultats. Ces études multicentriques se sont avérées difficiles à produire en raison du manque de standardisation de la méthode. Au cours des deux dernières années, plusieurs articles ont abordé le problème de la grande variabilité inter-laboratoires pour la méthode TGA-CAT en présentant des protocoles de normalisation soigneusement élaborés. L'accent a été mis à la fois sur la méthode elle-même et ses facteurs pré-analytiques ainsi que sur l'utilisation de plasmas de référence (RP) pour la normalisation des résultats. Un article a montré que le choix du RP pour la normalisation des résultats pouvait fortement réduire la variabilité inter-laboratoires et que certains RP avaient une meilleure capacité à le faire (7).

Dernièrement, un certain nombre de médicaments recombinants à base de facteur VIII (rFVIII) et IX (rFIX) à demi-vie prolongée ont été développés et sont sur le point d'être commercialisés ou même l'ont déjà été. La durée de l'activité prolongée du médicament diffère d'un patient à l'autre et la nécessité d'une adaptation individuelle de l'administration du médicament au patient est évidente. La génération de thrombine pourrait s'avérer être un excellent outil pour adapter l'administration optimale du médicament et surveiller l'effet du médicament pour chaque individu.

Méthodes et matériels Génération de thrombine La génération de thrombine sera mesurée selon la méthode décrite par Hemker et al.(8) : thrombogramme automatisé calibré (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Pays-Bas).

Réactifs PPP-reagent LOW (1 pM), PPP-reagent (5 pM), Thrombin Calibrator et FluCa-kit (TS31.00, TS30.00, TS20.00 et TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Pays-Bas) sera utilisé dans le test.

Echantillons Trois plasmas différents seront testés, plasma normal, plasma hypo- et hypercoagulable. Le plasma normal et hypercoagulable sera regroupé à partir de 3 donneurs et le plasma hypocoagulable sera prélevé à partir de 4 donneurs. Du plasma hypocoagulable sera prélevé sur cinq patients atteints d'hémophilie A (HA) régulièrement traités à l'unité de coagulation de Malmö en prélevant 10 tubes de 4,5 ml de sang citraté en une seule fois. Le plasma normal sera collecté auprès de 3 collègues de la même unité, chaque personne donnant 13 tubes de 4,5 ml de sang citraté. Du plasma hypercoagulable sera préparé à partir de 3 volontaires sains, présentant des valeurs de paramètre TGA CAT> 2 SD de la médiane en prenant 13 tubes de 4,5 ml de sang citraté. Le plasma d'un patient atteint d'HA sévère qui a reçu des concentrés de FVIII, Advate™ respectivement Adynovate™ à action prolongée à deux occasions distinctes sera également testé. Après consentement éclairé, il sera demandé au patient de ne pas prendre sa dose habituelle de prophylaxie pendant 72 heures. Le patient recevra respectivement Advate™ et Adynovate™ à raison de 30 U/kg. Les échantillons de contrôle seront prélevés 1h, 8h, 24h, 36h et 48h (Advate™) et 1h, 24h, 36h, 48h et 72h (Adynovate™) après l'injection. À chaque instant, 3 tubes de 4,5 mL de sang seront prélevés.

Les plasmas de référence Siemens Control Plasma P dilué 1:5 seront utilisés comme RP hypocoagulable, le plasma d'étalonnage HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, USA) sera utilisé comme RP standard et comme plasma hypercoagable PS-DP (plasma de déficience en protéine S) (Laboratoires de recherche sur les enzymes, South Bend, In, USA) seront utilisés.

Analyse statistique Les données brutes seront collectées et analysées à l'unité de coagulation, hôpital universitaire de Skåne, Malmö. Chaque centre participant sera jumelé avec l'unité de coagulation de Malmö dans un test de concordance où le graphique de biais de Bland-Altman sera utilisé. La moyenne, l'écart type (SD) et le coefficient de variation (CV%) seront calculés pour chaque centre avec et sans normalisation et affichés dans un tableau. Les profils d'élimination Advate/Adynovate seront tracés et des analyses de variance à mesures répétées multivariées, y compris un test général pour les courbes parallèles, seront appliquées pour évaluer les différences entre les centres dans les profils d'élimination.

Conception de l'étude L'étude vise à évaluer la variabilité inter-laboratoires du TGA-CAT effectué avec un protocole hautement standardisé, comment l'utilisation des RF pour la normalisation des données a un impact sur la variabilité des résultats et à évaluer l'utilité du TGA-CAT dans la surveillance prolongée Administration de médicaments FVIII. Tous les fluorimètres des centres participants doivent être entretenus et avoir une température calibrée à 37 C avant le début de l'étude. La dernière version du logiciel doit être installée (Thromboscope BV, Maastricht, Pays-Bas, version V5.0.0.742). Tous les équipements de laboratoire, pipettes, bains-marie, purificateurs d'eau, etc., doivent être calibrés. Tous les plasmas, les réactifs TGA-CAT nécessaires à l'étude seront administrés et distribués à tous les centres participants par l'unité de coagulation de Malmö. Une clé USB contenant un fichier de schéma de configuration de plaque et un fichier vidéo couvrant les étapes pré-analytiques et analytiques critiques seront également fournies avec les échantillons et les réactifs. Trois pools de plasmas (normal, hypo- et hypercoaguable), trois échantillons de surveillance RF, cinq Adynovate et cinq Advate seront analysés cinq fois sur cinq jours différents par chaque centre participant, selon un schéma fourni dans la clé USB, avec deux échantillons différents. déclencheurs, PPP-réactif LOW (1 pM) et PPP-réactif (5 pM). Deux essais sont programmés chaque jour pour optimiser l'utilisation des RF et des réactifs. La raison du test de trois types différents de RF est le fait que les résultats d'une étude antérieure impliquaient une meilleure réduction de la variabilité lors de l'utilisation, par exemple, d'un RF hypocoaguable à des plasmas hypocoaguables (9).