鼻过敏原暴露后适应性免疫反应和效应细胞反应的变化 - 初步研究

研究的合理性

先前关于鼻过敏原体内临床和免疫反应动力学的研究集中在特定参数上，但没有解决不同因素之间相互作用的动力学（即 过敏原特异性 IgE 水平、局部 IgE 和介质产生、嗜碱性粒细胞敏感性、皮肤敏感性）。 因此，研究人员提出了一项随机双盲安慰剂对照研究，其中研究人员用过敏原提取物鼻内刺激患者，然后在 4 个月的时间内密切监测临床和免疫反应。 此后，将在桦树季节前后进行 4 次访问。

研究人员将研究在花粉季节之外对桦树花粉提取物鼻腔挑战的即时和晚期免疫反应。 研究参与者最初将接受连续 3 天的鼻腔过敏原挑战，然后接受为期 1 年的密切随访。 为了评估对过敏原暴露的临床反应，研究人员将使用皮肤点刺试验 (SPT)、总鼻部症状评分 (TNSS)、鼻内窥镜检查和峰值吸气鼻流量计 (PNIF)。 为了评估免疫反应，将采集血液、鼻粘膜样本和鼻分泌物样本。

学习规划

在这项单中心、随机、安慰剂对照、双盲研究中，共有 36 名患者（6 名用于预研究）在自愿的基础上被招募到这项研究中，并将被随机分配接受白桦树的鼻腔挑战花粉提取物或安慰剂。 将根据 Bet v 1 特定 IgE 水平对随机化进行分层，以允许在两组中进行平等分配。 30 研究参与者将在桦树花粉季节之外连续三天接受桦树花粉提取物或安慰剂的鼻刺激，此后将定期随访长达四个月。

最初，在对 30 名患者进行研究之前，将对 6 名桦树花粉过敏受试者进行短期方案，以确保

1. 用于鼻刺激的过敏原浓度足以引起 IgE 抗体升高
2. 皮肤点刺试验的滴度是否足够

3. 即取鼻腔分泌物测定介质的时机是否合适。

   如果这 6 名患者的结果显示鼻过敏原浓度、皮肤测试滴度或鼻分泌物的时间不合适，将向伦理委员会提交修正案。

   缩短的协议将包括 5 次访问：

   • 完整的筛选访问
   • 完成访问 N1
   • 访问 N2 无需血液采样和鼻腔采样
   • 访问 N3 无需采血和鼻腔采样
   • 完成访问 N7

   筛选访问

   程序

   • 签署知情同意书（版本 2.1。 用于短方案的初步研究，1.8 版（为扩展而更新）用于主要研究）
   • 放映编号分配
   • 人口统计数据
   • 过敏史
   • 纳入和排除标准的评估
   • 如果需要 SPT，则对女性进行妊娠试验
   • 病史
   • 合并用药
   • 前鼻镜检查
   • 标准 SPT，含有来自以下来源的商业提取物：榛子、灰烬、混合草、豚草、艾蒿、屋尾蕨、粉尘螨、猫狗皮屑、链格孢属、枝孢属、组胺和阴性对照
   • 用商业桦树花粉提取物进行滴定皮肤点刺试验
   • 采血（最多60毫升肝素化血液和血清）- 部分血样将直接送往实验室进行嗜碱性粒细胞活化、总IgE和相关过敏原特异性IgE的分析。 从剩余的血液中制备 RNA 并在 -80°C 下储存，分离血清并在 -20°C 下储存
   • 鼻腔取样（鼻腔灌洗、粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）

   访问N0

   关于时间的要求：访问 N0 安排在访问 N1 之前的 2 周到 4 天之间。 这仅适用于 N1 就诊前超过 3 周接受筛查的患者

   程序：

   • 采血
   • 鼻标本采集（灌洗、粘膜刮匙采样和鼻分泌物采样）
   • 滴定SPT
   • PNIF
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   参观N1

   程序：

   • 重新评估 In 和排除标准（过敏原特异性 IgE 结果）
   • 随机化：受试者将被分配一个治疗编号
   • 基线血液采样
   • 基线鼻标本采集（灌洗、鼻粘膜取样和鼻分泌物取样）
   • 基线 TNSS 评分
   • 不良事件 (AE) 记录
   • 合并用药
   • 向患者提供 PNIF 并解释/演示其工作原理。 将为患者提供纸质日记以跟踪每日 PNIF 值（从 N1 到 N5）。 该乳制品还将用于记录每日 TNSS 分数 (N4-N5)。
   • 怀孕测试
   • 在。 施用桦树花粉提取物或安慰剂
   • 激怒后立即记录症状
   • 白桦花粉提取物给药后20分钟、40分钟、1小时、2小时、4小时、20-24小时（将在20-24小时时间点进行）血液、PNIF、鼻腔取样（鼻腔灌洗、粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）和TNSS评分在访问 N2)。
   • 桦树花粉提取物给药后 10 分钟、3 小时、5 小时、6 小时、7 小时、8 小时的鼻腔取样、PNIF 和 TNSS 评分
   • 滴定SPT
   • 必要时给予急救药物（氮卓斯汀鼻腔喷雾剂、地氯雷他定 5mg）

   访问 N2

   关于时间的要求：

   访问 N2 安排在访问 N1 之后的第二天

   程序：

   • 血液、PNIF、鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）和 TNSS 评分（N1 中施用桦树花粉提取物后 20-24 小时时间点）。
   • AE录音
   • 合并用药
   • 在。 施用桦树花粉提取物或安慰剂，然后观察 2 小时
   • 激怒后立即记录症状
   • 必要时给予急救药物（氮卓斯汀鼻腔喷雾剂、地氯雷他定 5mg）
   • 注意：在最初的 6 名研究对象中，将不会进行鼻腔和血液采样

   参观N3

   关于时间的要求：

   访问 N3 安排在访问 N2 之后的第二天

   程序：

   • 挑衅前采血
   • 激发前鼻标本采集（灌洗、粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）
   • 挑衅前的 TNSS 分数
   • 滴定SPT
   • 不良事件 (AE) 记录
   • 合并用药
   • 在。 施用桦树花粉提取物或安慰剂
   • 激怒后立即记录症状
   • 血液、PNIF、鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）和 TNSS 评分 20 分钟、40 分钟、1 小时、2 小时、4 小时、20-24 小时和桦树花粉提取物给药后（20-24 小时时间点将在访问 N4)。
   • 桦树花粉提取物给药后 10 分钟、3 小时、5 小时、6 小时、7 小时、8 小时的鼻腔取样、PNIF 和 TNSS 评分
   • 必要时给予急救药物（氮卓斯汀喷鼻剂、地氯雷他定 5mg）
   • 注意：在最初的 6 名研究对象中，将不会进行鼻腔和血液采样

   访问 N4

   关于时间的要求：

   访问 N4 安排在访问 N3 之后的第二天

   程序：

   • 施用桦树花粉提取物后20-24 小时的血液、PNIF、鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙取样和鼻分泌物取样）和TNSS 评分。

   参观N5

   访问 N5 安排在访问 N4 后 14 ± 4 天：

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • TNSS评分
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验
   • N1到N5探视纸质日记合集

   访问N6

   关于时间的要求：

   访问 N6 安排在访问 N5 后 14 ± 4 天

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   参观N7

   关于时间的要求：

   访问 N7 安排在访问 N6 后 14 ± 4 天

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问N8

   关于时间的要求：

   访问 N8 安排在访问 N7 后 14 ± 4 天

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • 分数
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问N9

   关于时间的要求：

   访问 N9 安排在访问 N8 后 14 ± 4 天

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   参观N10

   关于时间的要求：

   访问 N9 安排在访问 N9 后 14 ± 4 天

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问 N11 - 鼻部激发组件的最终访问

   关于时间的要求：

   就诊 N11 安排在就诊 N10 后 28 ± 4 天

   程序：

   • 血液用于免疫学参数和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • PNIF
   • 滴定SPT
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问 S1（延期——MUW 伦理委员会于 2019 年 2 月 11 日批准）

   关于时间的要求：访问 S1 安排在预计的桦树季节开始前 4 周（+/- 7 天）

   程序：

   • 纸质花粉和 PNIF 日记向患者解释并要求在桦树季节每天填写
   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • 滴定SPT
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问S2

   时间要求：访问 S2 安排在桦树季节结束后 4 周（+/- 7 天）

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • 收藏纸日记
   • 观察到的 PNIF
   • 滴定SPT
   • 就诊时的 TNSS 评分
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问 S3

   关于时间的要求：

   访问 S3 安排在访问 S2 后 4 周 -（+/- 7 天）

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • 观察到的 PNIF
   • 滴定SPT
   • 就诊时的 TNSS 评分
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验

   访问 S4 和学习结束

   关于时间的要求：

   访问 S4 安排在整个研究开始后 1 年（访问 N0 后 1 年）+/- 7 天

   程序：

   • 血液和鼻腔取样（灌洗、粘膜刮匙和鼻分泌物取样）
   • 观察到的 PNIF
   • 滴定SPT
   • 就诊时的 TNSS 评分
   • AE录音
   • 如果最后一次测试是在一个多月前，则对女性进行妊娠试验
   • 研究结束

   研究程序说明

   患者的病史、人口统计数据、合并用药 将询问患者的病史，包括人口统计数据和合并用药、他们的过敏症状（包括强度和持续时间）以及他们的过敏用药史。

   过敏史和 TNSS 评分

   将要求患者出现打喷嚏、流鼻涕、鼻痒、鼻塞和睡眠质量，并在每次就诊时对每种症状进行分级并在家中记录。 他们将使用以下症状评分方法：0 = 不存在； 1 = 轻微 - 存在但容易耐受； 2 = 中度 - 存在，症状令人烦恼但不影响日常生活活动； 3 = 严重 - 症状难以忍受并且干扰日常生活活动 (24)。 除此之外，表格上还会显示总疾病负担的视觉模拟量表。

   前鼻镜检查

   在筛选访视期间将进行一次前鼻镜检查以排除解剖学差异（例如 间隔偏差）或病理变化（例如 鼻息肉）。 它将通过使用窥器进行，患者坐着，头部略微向后。

   峰值吸气鼻流量计 (PNIF)

   PNIF 的便携性和易用性为患者在家中获得客观测量值提供了独特的机会。 它最近也被验证为鼻过敏原挑战期间的研究工具。

   程序：

   在访问 1 时，患者将接受如何使用 PNIF 设备（检查中，吸气流量计）的培训，并将收到一个带回家，直到 N5。 PNIF 使用直接以升/分钟为单位校准的可变直径管以及低惯性指示环。 吸气操作后环的位置指示达到的最大流量。 当患者通过嘴巴或鼻子吸气时，该设备就会工作，这会导致空气被吸入仪表，并且光标会沿着刻度移动以指示吸入速度。 可以通过对照校准刻度检查光标的位置来记录所达到的流速。

   PNIF 在研究行为中的作用：

   PNIF 将提供给研究参与者带回家，这样他们就可以每天或每周记录一次鼻腔气流（取决于研究的阶段）。 他们还将被要求将它们带到所有研究访问中，以便可以进行观察到的 PNIF 测量。

   皮肤点刺试验

   4.5.1 程序：通过用一滴（20ul）含过敏原的溶液用无菌柳叶刀轻轻刺破皮肤，将过敏原插入前臂的真皮中，每个单独的应用点之间至少有 2 厘米的距离。 0.9%氯化钠溶液用作阴性对照，组胺用作阳性对照。 在以前过敏的个体中，在受到相应过敏原攻击后的 15 分钟内，会出现皮肤发痒肿胀和发红（风团和耀斑反应）。 20 分钟后，擦去过敏原溶液，并用圆珠笔描绘风团的边缘。 将透明胶带粘在皮肤上，以便将风团的轮廓转移到胶带上进行记录。 风团的表面将通过数字面积测量法计算。 对于包含物，直径至少为 3 mm 的风团将被视为阳性反应。

   测试解决方案：

   市售的桦树花粉提取物和一组树和草花粉、杂草和多年生过敏原（Allergopharma，Vienna，Austria）将在筛选访视时使用，并将根据制造商的说明进行储存。 作为对照，将使用无菌 0.9% NaCl 溶液（阴性对照）和组胺（阳性对照，Allergopharma，Vienna，Austria）。 它们将根据制造商的说明进行存储。

   SPT 的学习行为：

   放映访问：

   将使用商业桦树花粉提取物和一组树和草花粉、杂草和多年生过敏原（所有 Allergopharma，奥地利维也纳）进行标准皮肤点刺试验，用于耳鼻喉科过敏诊所的常规诊断，以评估筛选访视时患者的致敏情况。

   筛选和访问 N0、N5 - N11、S1-S4 对桦树提取物进行滴定皮肤点刺试验，稀释度增加（稀释度将增加 3 倍，直至 1:60 000（=11 个稀释步骤）以确定引起皮肤反应的最低浓度。 对所有稀释液的皮肤测试一式四份进行。 商业阳性对照溶液（组胺）和阴性对照将一式两份进行。

   安全预防措施 作为安全预防措施，将在测试后对患者进行 30 分钟的监测。 所有检查都将在耳鼻喉科的门诊进行，那里有全套急救设备。

   血液采样和免疫参数测量

   血液样本将在筛选访问和所有研究访问中通过皮肤测试前的肘前静脉穿刺采集。 每次访问最多 60 毫升，或者肝素化（例如用于嗜碱性粒细胞敏感性测定）或用于制备血清（例如用于评估总免疫球蛋白和过敏原特异性免疫球蛋白水平或 RBL 测定）。 将处理血清瓶并将血清储存在-20°C。 筛选访问的血液样本的过敏原特异性 IgE 将通过 CAP-FEIA 测量，以评估患者的过敏原特异性 RAST 等级。 总的、游离的和过敏原特异性血清 IgE、IgG、IgA 和 IgM 的测量将通过 CAP-FEIA、微阵列测量或 ELISA 进行。 将在研究结束时对所有收集的血清样本进行测量，以尽量减少批间变异。 将在每次就诊时测量嗜碱性粒细胞对过敏原、fMLP 和抗 IgE 的反应。 简言之，将嗜碱性粒细胞暴露于各种浓度的抗IgE、fMLP或重组过敏原15分钟，然后通过流式细胞术检查CD 63和CD203c的表达。 或者，组胺释放将通过市售的组胺释放试剂盒来确定。

   妊娠试验

   在女性患者中，将通过标准尿妊娠试验排除妊娠。 该测试将在筛选访问的第一次皮肤点刺测试之前进行，之后每月一次。

   鼻标本采集

   鼻腔标本采集将在所有访视时进行。 每次就诊都将使用鼻吸法 FXi/PU（包含合成吸收基质 (SAM)）或 10 厘米长的塑料刮匙（两种设备均来自英国 Hunt Developments）收集标本

   使用 FXi/PU（Hunt Developments，英国）的鼻吸：

   在可视化下，该设备将被插入鼻腔并沿侧壁放置在下鼻甲上。 患者的食指将用于按压鼻翼和侧鼻软骨的外部，以将装置固定到位。 1 分钟后，将移除设备并通过离心提取液体。 上清液将在 -70°C 下冷冻，直到进一步分析过敏原特异性和总 Ig 水平、介质和细胞因子水平的存在。

   粘膜 mRNA 取样 将使用 10cm 的鼻刮匙。 在直视下，刮匙将靠在下鼻甲的中下部。 将刮匙压在粘膜表面，向外移动2-3次。 此动作将重复 2-3 次以确保良好的样本采集。 这种刮匙和技术已被证明不会给患者带来明显的不适，因此它具有不需要局部麻醉的优点。 收集后，细胞将在 Qiagen RLT 缓冲液中裂解并储存在 -70°C 以供以后进行 mRNA 分析。

   4.9 鼻内挑战

   桦树花粉提取物（Allergopharma，维也纳，奥地利）将在无菌的 0.9% 氯化钠溶液中新鲜稀释，并使用计量泵给药。 在访问 N1、N2、N3 时，将使用计量泵向两个鼻孔输送 15 μl 每次喷出 15 μl 的过敏原。 如果患者在挑战后出现鼻部或眼部症状，将提供氮卓斯汀鼻喷雾剂或地氯雷他定 5mg。

   随机程序

   在主要研究的访问 N1 中，患者将被随机分配到两组之一（桦树花粉提取物或安慰剂）。 研究对象将使用在线随机化程序“randomizer”(www.meduniwien.ac.at/randomizer) 进行随机化（激发与控制的比例为 2:1），该程序由医学信息学、统计和文献研究所维护格拉茨大学，格拉茨，奥地利。 选择 2:1 比率是因为由于预期整体 Ig 水平较高，Ig 测量值和派生数量的方差预计在激发组中较大，另请参阅本文档后面的样本量考虑。

   随机化将由未参与研究且与患者没有接触的人员进行，以确保研究是双盲的。

   研究产品和研究药物

   桦树花粉提取物：

   桦树花粉提取物（Allergopharma，Vienna，Austria）将用于鼻内攻击。 桦树花粉提取物将冻干并溶解在无菌的 0.9% 氯化钠中。 提取物中 Bet v 1 的含量将使用 Bet v 1 特异性抗体探针通过免疫印迹法确定。最后，将稀释提取物，使 Bet v 1 的最终浓度为 50 μg/ml，因为该浓度之前已经过显示在鼻攻击后引起特定 IgE 水平的变化。

   控制解决方案：

   对照溶液将包含 0.9% 的氯化钠作为皮肤点刺试验的阴性对照和作为鼻内攻击的安慰剂。 组胺 (Allergopharma, Vienna, Austria) 将用作皮肤点刺试验的阳性对照。 它们将根据制造商的说明进行存储。

   合并用药

   一般的：

   受试者在进入研究时或在研究期间的任何时间服用的所有额外药物均被视为伴随药物，并将记录在源数据文件中。 在研究期间应将伴随药物保持在最低限度，但如果认为有必要，在不干扰研究方案的情况下可以给予。

   抢救药物：

   尽管在本研究中发生过敏事件的可能性很小，但始终必须将其视为可能发生。 因此，如果在 SPT 或鼻腔挑战时出现过敏反应，将立即提供完整的应急包。 此外，如果患者在鼻内攻击后出现鼻部和眼部症状，将提供氮卓斯汀鼻喷雾剂和/或地氯雷他定 5mg 以改善症状。

   禁止合并用药：

   在研究期间，受试者必须停止服用干扰研究程序的药物。 本研究期间不允许进行以下伴随治疗：

   • 全身或局部皮质类固醇
   • 其他免疫抑制剂
   • 就诊前 3 天服用抗组胺药或色甘酸二钠
   • 全身性或鼻内肾上腺素能药物
   • 精神药理学药物
   • ACE 抑制剂或 β 受体阻滞剂

   不良事件

   不良事件是临床研究期间的任何事件，包括并发疾病或事故，这会损害受试者的健康；它也可能表现为异常的实验室值。 术语不良事件并不意味着与研究治疗有因果关系。

   所有经历不良事件的受试者——无论是否被认为与使用研究治疗有关——都将受到监测，直到症状消退并且任何异常实验室值恢复到基线，或者直到对观察到的变化有一个令人满意的解释，或者直到死亡，在这种情况下，将提供合格病理学家的完整病理报告。 所有发现都必须在病例记录表中的“不良事件”页面上报告。

   将如下所述报告和记录所有不良事件。 不良事件分为“严重”和“不严重”两类。 这决定了必须用于报告/记录不良事件的程序。

   严重和非严重不良事件的定义

   严重不良事件是：

   • 任何致命或危及生命的事件
   • 任何永久禁用的事件
   • 任何需要或延长住院治疗的事件
   • 任何涉及癌症、先天性异常或因过量服用（超过规定剂量的应用）而发生的事件。

   不属于这些类别的不良事件被定义为不严重。

   AE 严重程度的评估

   无论将不良事件分类为严重或不严重（见上文），其严重程度必须仅根据医学标准评估为轻度、中度或重度：

   轻度 = 不干扰日常活动，可接受 中度 = 干扰日常活动 重度 = 无法进行日常活动，被医生认为是不可接受的，需要治疗，需要停止研究，或有残留影响。

   应该注意的是，严重的不良事件不一定是严重的。 无论严重程度如何，所有严重不良事件都必须按以下方式报告。

   不良事件的报告/记录

   通过自发报告收集不良事件。

   严重不良事件的报告/记录

   在本研究期间发生的所有严重不良事件，无论是否被认为与研究药物有关，都必须记录在病例记录表的“不良事件”页面上。

   必须准备并收集一份后续报告，其中包括获得的有关严重事件的所有新信息。

   调查员将根据要求向伦理委员会提交所有这些报告的副本。 必要时，调查人员会通知当局。

   非严重不良事件的报告/记录

   这些将记录在病例记录表的“不良事件”页面上。

   统计分析

   由于这是一项试点研究，所执行的分析被认为是探索性和假设生成。

   将通过计算度量变量的最大值、最小值、中值、平均值和标准差以及分类变量的绝对和相对频率来描述患者特征和结果变量。

   为了分析 IgE 水平和其他结果变量的时间轨迹，将分别计算每个时间点和每个治疗组的描述性统计数据以及平均值的 95% 置信区间。 为了解释患者之间的异质基线水平，每个患者的观察结果将通过这些分析的各自基线值标准化。 此外，将为每个时间点计算组间的平均差异和相应的 95% 置信区间。 对于图形说明，将绘制每个患者的个体轨迹。

   在皮肤点刺试验中观察到的数据包括一系列过敏原剂量和由此产生的面积测量值。 根据先前研究中八名患者的初步数据，发现 Area = A*(1-exp(-λ Dose) 类型的指数模型可以恰当地描述皮肤点刺试验中观察到的剂量-反应关系。 该模型将使用非线性最小二乘算法拟合每个组中的每个时间点。 从这些模型中，响应率 λ、平台面积 A 和 50% 有效剂量将与 95% 置信区间一起报告。

   如果存在缺失值，所有分析都将在可用案例的基础上进行。

   样本量注意事项：

   鉴于研究的探索性，样本量的考虑基于参数估计的精度。 主要目标是跨时间分析 IgE 水平。 先前研究的日期显示，在用 Bet v 1 进行鼻刺激后 4 周，抗 Bet v 1 IgE 的相对增加了 1.4，患者之间的标准差约为 0.5。 对于对照抗原，平均因子为 1.04，标准差约为 0.25。 如果分配比率与标准偏差比率成正比，即根据先前数据为 2:1，则可实现两组平均值比较的最大统计精度。 根据上述关于效应量和标准差的假设，总样本量 30 (20:10) 将提供 95% 的置信区间，每组的半宽约为 0.2。 组间平均差的 95% 置信区间的预期半宽为 0.28。 （相应的双样本 t 检验将具有 80% 的功效来检测 5% 显着性水平下 0.4 的平均差异）。 对于皮肤点刺试验的分析，初步数据表明，样本量为 20 时，50% 有效剂量的 95% 置信区间的半宽约为 50% 有效剂量的 0.25 倍，这被认为作为本试点研究的足够精确度。 图形表示见附件

   道德和法律方面

   该研究将按照当地法律要求和 GCP 进行。 它将根据赫尔辛基宣言（1964 年）的指导方针进行，包括当前的修订。

   受试者的知情同意

   在被允许参加研究之前，受试者必须在以他/她可以理解的形式解释了临床研究的性质、范围和可能的后果之后同意参与。 受试者必须书面同意。 研究者的签名将确认受试者的同意。 即使没有发表评论，患者也可以随时撤回同意，且不会对其未来的医疗护理产生负面影响。

   确认/批准研究

   在研究开始之前，研究方案将提交给维也纳医科大学和维也纳综合医院（Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Vienna, Austria）的伦理委员会。

   保险

   参与本研究的所有受试者都将在苏黎世保险公司 (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel. +43 50 1255 1255；保险号：07229622-2）。

   保密

   所有受试者的姓名都将在调查人员档案中保密。 在整个记录和评估过程中，将根据研究期间分配给他们的人数来识别受试者。 受试者将被告知所有研究结果都将以最严格的保密方式存储和处理。

   研究结果的记录和使用

   研究结果的文件

   研究期间收集的所有结果将收集在源数据文件中，随后将转移到病例报告表 (CRF) 中。 病例记录表上的所有条目都将用黑色或蓝色墨水清楚地书写。 如果对案例记录表中的条目进行了更正，文字或数字将被圈起来，并在其中画出一个笔划。 将在旧条目和日期旁边输入正确的值，并在更正处加上草签。 不正确的条目不得用涂改液覆盖或以任何方式涂掉或使其难以辨认。 完成的 CRF 将由研究者签名。 CRF 将在期末考试后立即完成。 CRF 所依据的医疗记录将至少保存 15 年。

   研究结果的使用

   这项研究的结果将由研究人员在科学期刊上发表，并在科学会议上发表。 手稿将在提交前分发给所有合作研究者。