Zmiany w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych i odpowiedziach komórek efektorowych po ekspozycji na alergen nosowy - badanie pilotażowe

Racjonalne badanie

Wcześniejsze badania nad dynamiką klinicznych i immunologicznych odpowiedzi in vivo na alergeny nosowe koncentrowały się na określonych parametrach, ale nie dotyczyły kinetyki interakcji między różnymi czynnikami (tj. poziom swoistych dla alergenu IgE, lokalna produkcja IgE i mediatorów, wrażliwość na bazofile, wrażliwość skórna). Dlatego badacze proponują randomizowane, podwójnie ślepe badanie kontrolowane placebo, w którym badacze prowokują pacjentów donosowo ekstraktem alergenu, a następnie ściśle monitorują zarówno kliniczne, jak i immunologiczne reakcje immunologiczne przez okres 4 miesięcy. Następnie odbędą się kolejne 4 wizyty przed i po sezonie brzozowym.

Badacze przyjrzą się natychmiastowej i późnej fazie odpowiedzi immunologicznych na prowokację donosową ekstraktem z pyłku brzozy poza sezonem pylenia. Uczestnicy badania przejdą początkowo 3 kolejne dni prowokacji alergenem donosowym, a następnie będą pod ścisłą obserwacją przez okres 1 roku. Aby ocenić odpowiedź kliniczną na ekspozycję na alergen, badacze wykorzystają punktowy test skórny (SPT), całkowitą ocenę objawów nosowych (TNSS), endoskopię nosa i szczytowy wdechowy przepływomierz nosowy (PNIF). W celu oceny odpowiedzi immunologicznych zostaną pobrane próbki obejmujące krew, próbki błony śluzowej nosa i wydzieliny z nosa.

Projekt badania

W tym jednoośrodkowym, randomizowanym, kontrolowanym placebo badaniu z podwójnie ślepą próbą łącznie 36 (6 w przypadku badania wstępnego) zostanie włączonych do tego badania na zasadzie dobrowolności i zostanie losowo przydzielonych do prowokacji donosowej albo ekstrakt z pyłku kwiatowego lub placebo. Randomizacja zostanie podzielona na warstwy zgodnie z poziomami IgE swoistymi dla Bet v 1, aby umożliwić równą dystrybucję w obu grupach. 30 Uczestnicy badania otrzymają prowokację do nosa poza sezonem pylenia brzozy za pomocą ekstraktu z pyłku brzozy lub placebo przez trzy kolejne dni, a następnie będą poddawani regularnej obserwacji przez okres do czterech miesięcy.

Początkowo, przed badaniem na 30 pacjentach, 6 osób z alergią na pyłki brzozy zostanie poddanych krótkiemu protokołowi w celu upewnienia się, że

1. Stężenie alergenu użyte do prowokacji donosowej jest wystarczające do wywołania wzrostu przeciwciał IgE
2. Czy miareczkowanie punktowego testu skórnego jest odpowiednie

3. Czy termin pobrania wydzieliny z nosa w celu oznaczenia mediatorów jest odpowiedni.

   Jeżeli wyniki tych 6 pacjentów wykażą, że stężenie alergenu w nosie, miareczkowanie testu skórnego lub czas wydzieliny z nosa nie są odpowiednie, poprawka zostanie przedłożona komisji etycznej.

   Skrócony protokół obejmie 5 wizyt:

   • pełna wizyta przesiewowa
   • pełna wizyta N1
   • odwiedzić N2 bez pobierania krwi i bez pobierania próbek z nosa
   • odwiedzić N3 bez pobierania krwi i bez pobierania próbek z nosa
   • pełna wizyta N7

   Wizyta przesiewowa

   Procedura

   • Podpisanie formularza świadomej zgody (wersja 2.1. do badania wstępnego z krótkim protokołem, wersja 1.8 (zaktualizowana w celu rozszerzenia) do badania głównego)
   • Przydział numeru kontrolnego
   • Dane demograficzne
   • Historia alergii
   • Ocena kryteriów włączenia i wykluczenia
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli wymagają SPT
   • Historia medyczna
   • Leki towarzyszące
   • Rynoskopia przednia
   • Standardowy SPT z handlowym ekstraktem z: leszczyny, jesionu, mieszanki traw, ambrozji, bylicy pospolitej, D. pteronyssinus, D. farina, sierści kota i psa, alternarii, cladosporium, histaminy i kontroli negatywnej
   • Miareczkowany punktowy test skórny z komercyjnym ekstraktem z pyłku brzozy
   • Pobieranie krwi (maks. 60ml heparynizowanej krwi i surowicy) - Część próbki krwi zostanie przesłana bezpośrednio do laboratorium w celu analizy aktywacji bazofilów, całkowitego IgE i swoistych IgE na odpowiednie alergeny. Z pozostałej krwi zostanie przygotowany RNA i przechowywany w temperaturze -80°C, a surowica zostanie oddzielona i przechowywana w temperaturze -20°C
   • pobieranie próbek z nosa (płukanie nosa, pobieranie próbek z kirety śluzowej i pobieranie wydzieliny z nosa)

   Odwiedź N0

   Wymagania dotyczące terminu: Wizyta nr 0 jest planowana od 2 tygodni do 4 dni przed wizytą N1. Dotyczy to tylko pacjentów, którzy zostali poddani badaniu przesiewowemu więcej niż 3 tygodnie przed wizytą N1

   Procedura:

   • Pobieranie próbek krwi
   • Pobieranie wycinków z nosa (płukanie, pobieranie próbek z kirety śluzowej i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • Miareczkowana SPT
   • PNIF
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź N1

   Procedura:

   • Ponowna ocena kryteriów włączenia i wykluczenia (wyniki swoistych dla alergenu IgE)
   • Randomizacja: Osobnikom zostanie przydzielony numer leczenia
   • Wyjściowe pobieranie krwi
   • Wyjściowe pobieranie próbek z nosa (płukanie, pobieranie próbek błony śluzowej nosa i pobieranie próbek wydzieliny z nosa)
   • Wyjściowy wynik TNSS
   • Rejestrowanie zdarzeń niepożądanych (AE).
   • Leki towarzyszące
   • PNIF podawany pacjentom i wyjaśnienie/demonstracja, jak to działa. Pacjenci otrzymają papierowy dziennik, w którym będą rejestrować dzienne wartości PNIF (od N1 do N5). Ta mleczarnia będzie również używana do rejestrowania dziennych wyników TNSS (N4-N5).
   • Test ciążowy
   • W. podanie ekstraktu z pyłku brzozy lub placebo
   • Dokumentacja objawów bezpośrednio po prowokacji
   • Krew, PNIF, pobieranie próbek z nosa (płukanie nosa, pobieranie próbek błony śluzowej do łyżeczkowania i pobieranie wydzieliny z nosa) oraz punktacja TNSS, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 20-24 h po podaniu ekstraktu z pyłku brzozy (punkt czasowy 20-24 zostanie przeprowadzony na wizycie N2).
   • Pobieranie próbek z nosa, ocena PNIF i TNSS po 10 min, 3 godz., 5 godz., 6 godz., 7 godz., 8 godz. po podaniu ekstraktu z pyłku brzozy
   • Miareczkowana SPT
   • podanie leku doraźnego w razie potrzeby (azelastyna w aerozolu do nosa, desloratadyna 5 mg)

   Odwiedź N2

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N2 planowana jest dzień po wizycie N1

   Procedura:

   • Krew, PNIF, pobieranie próbek z nosa (płukanie, pobieranie próbek z kirety śluzowej i pobieranie próbek wydzieliny z nosa) oraz wynik TNSS (punkt czasowy 20-24 godzin po podaniu ekstraktu z pyłku brzozy w N1).
   • Nagrywanie AE
   • Leki towarzyszące
   • W. podanie ekstraktu z pyłku brzozy lub placebo, po czym następuje okres obserwacji trwający 2 godziny
   • Dokumentacja objawów bezpośrednio po prowokacji
   • podanie leku doraźnego w razie potrzeby (azelastyna w aerozolu do nosa, desloratadyna 5 mg)
   • Uwaga: u pierwszych 6 badanych osób pobieranie próbek krwi i nosa nie będzie wykonywane

   Odwiedź N3

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N3 planowana jest dzień po wizycie N2

   Procedura:

   • Pobieranie krwi przed prowokacją
   • Pobranie wycinków z nosa przed prowokacją (płukanie, pobieranie próbek z kirety śluzowej i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • Wynik TNSS przed prowokacją
   • Miareczkowana SPT
   • Rejestrowanie zdarzeń niepożądanych (AE).
   • Leki towarzyszące
   • W. podanie ekstraktu z pyłku brzozy lub placebo
   • Dokumentacja objawów bezpośrednio po prowokacji
   • Krew, PNIF, pobieranie próbek z nosa (płukanie, pobieranie próbek wyłyżeczki śluzowej i wydzieliny z nosa) oraz wynik TNSS 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 20-24 h i po podaniu ekstraktu z pyłku brzozy (punkt czasowy 20-24 godz. odwiedź N4).
   • Pobieranie próbek z nosa, ocena PNIF i TNSS po 10 min, 3 godz., 5 godz., 6 godz., 7 godz., 8 godz. po podaniu ekstraktu z pyłku brzozy
   • W razie potrzeby podanie leku doraźnego (azelastyna w aerozolu do nosa, desloratadyna 5 mg)
   • Uwaga: u pierwszych 6 badanych osób pobieranie próbek krwi i nosa nie będzie wykonywane

   Odwiedź N4

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N4 planowana jest dzień po wizycie N3

   Procedura:

   • Krew, PNIF, pobieranie próbek z nosa (płukanie, pobieranie próbek błony śluzowej łyżeczką i pobieranie próbek wydzieliny z nosa) oraz wynik TNSS po 20-24 godzinach od podania ekstraktu z pyłku brzozy.

   Odwiedź N5

   Wizyta N5 jest planowana 14 ±4 dni po wizycie N4:

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • wynik TNSS
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu
   • Zbiór dzienników papierowych z wizyt N1 do N5

   Odwiedź N6

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N6 jest planowana 14 ±4 dni po wizycie N5

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź N7

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N7 planowana jest 14 ±4 dni po wizycie N6

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź N8

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N8 jest planowana 14 ±4 dni po wizycie N7

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • wynik
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź N9

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N9 planowana jest 14 ±4 dni po wizycie N8

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź N10

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N9 planowana jest 14 ±4 dni po wizycie N9

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Wizyta N11 — wizyta końcowa komponentu prowokacji przez nos

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta N11 planowana jest 28 ±4 dni po wizycie N10

   Procedura:

   • Krew do badania parametrów immunologicznych i pobierania próbek z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Wizyta S1 (przedłużenie - zatwierdzone przez Komisję Etyki WUM w dniu 11.02.2019)

   Wymagania dotyczące terminów: Wizyta S1 planowana jest na 4 tygodnie przed przewidywanym rozpoczęciem sezonu brzozowego (+/- 7 dni)

   Procedura:

   • Pyłek papierowy i dzienniczek PNIF wyjaśniono pacjentom i poproszono o codzienne wypełnianie w okresie brzozowym
   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • Miareczkowana SPT
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź S2

   Wymagania dotyczące terminu: Wizyta S2 planowana jest 4 tygodnie po zakończeniu sezonu brzozowego (+/- 7 dni)

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • Pamiętnik papierowy do zbierania
   • Obserwowany PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Wynik TNSS podczas wizyty
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź S3

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta S3 planowana 4 tygodnie po wizycie S2 - (+/- 7 dni)

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • Obserwowany PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Wynik TNSS podczas wizyty
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu

   Odwiedź S4 i Koniec nauki

   Wymagania dotyczące czasu:

   Wizyta S4 planowana 1 rok po rozpoczęciu całego badania (1 rok po wizycie N0) +/- 7 dni

   Procedura:

   • Pobieranie krwi i wymazu z nosa (płukanie, kireta śluzowa i pobieranie wydzieliny z nosa)
   • Obserwowany PNIF
   • Miareczkowana SPT
   • Wynik TNSS podczas wizyty
   • Nagrywanie AE
   • Test ciążowy dla kobiet, jeśli ostatni test był ponad miesiąc temu
   • Koniec studiów

   Opisy procedur badania

   Historia medyczna pacjentów, dane demograficzne, leki towarzyszące Pacjenci zostaną poproszeni o podanie historii medycznej, w tym danych demograficznych i leków towarzyszących, objawów alergicznych, w tym nasilenia i czasu trwania, oraz historii leków alergicznych.

   Historia alergii i wynik TNSS

   Pacjenci będą proszeni o występowanie kichania, wycieku z nosa, świądu nosa, przekrwienia błony śluzowej nosa i jakości snu oraz o ocenę każdego objawu podczas każdej wizyty i prowadzenie rejestru w domu. Użyją następującej metody oceny objawów: 0 = nieobecny; 1 = łagodna – obecna, ale dobrze tolerowana; 2 = umiarkowany – obecny, objaw jest dokuczliwy, ale nie przeszkadza w codziennych czynnościach; 3 = ciężki – objaw jest trudny do zniesienia i utrudnia codzienne czynności (24). Oprócz tego na formularzu pojawi się wizualna analogowa skala całkowitego obciążenia chorobą.

   Rynoskopia przednia

   Rynoskopia przednia zostanie wykonana raz podczas wizyty przesiewowej w celu wykluczenia odchyleń anatomicznych (np. skrzywienie przegrody) lub zmiany patologiczne (np. polipy nosa). Zostanie on wykonany za pomocą wziernika, gdy pacjent siedzi z głową lekko do tyłu.

   Szczytowy wdechowy miernik przepływu do nosa (PNIF)

   Przenośność i łatwość PNIF zapewnia wyjątkową możliwość uzyskania obiektywnych pomiarów, gdy pacjenci są w domu. Został on również niedawno zatwierdzony jako narzędzie badawcze podczas prowokacji alergenem donosowym.

   Procedura:

   Podczas pierwszej wizyty pacjenci zostaną przeszkoleni, jak korzystać z urządzenia PNIF (przepływomierz kontrolny, wdechowy) i otrzymają jedno urządzenie, które zabiorą ze sobą do domu do N5. PNIF wykorzystuje rurkę o zmiennej średnicy skalibrowaną bezpośrednio w litrach na minutę wraz z pierścieniem wskaźnika o niskiej bezwładności. Pozycja pierścienia po manewrze wdechowym wskazuje maksymalny osiągnięty przepływ. Urządzenie działa, gdy pacjent robi wdech ustami lub nosem, co powoduje zassanie powietrza przez miernik, a kursor przesuwa się po skali, wskazując prędkość wdechu. Uzyskane natężenie przepływu można odnotować, sprawdzając położenie kursora względem skalibrowanej skali.

   PNIF w prowadzeniu badań:

   PNIF zostanie przekazany uczestnikom badania do zabrania do domu, aby mogli zachować dzienny lub tygodniowy nabiał (w zależności od fazy badania) przepływu powietrza przez nos. Zostaną również poproszeni o przyniesienie ich na wszystkie wizyty studyjne, aby można było wykonać obserwowane pomiary PNIF.

   Punktowy test skórny

   4.5.1 Procedura: Alergeny wprowadza się do skóry właściwej przedramienia, delikatnie nakłuwając skórę przez kroplę (20 μl) roztworu zawierającego alergen sterylnym lancetem w odległości co najmniej 2 cm między poszczególnymi punktami aplikacji. 0,9% roztwór chlorku sodu zostanie użyty jako kontrola negatywna, a histamina jako kontrola pozytywna. U wcześniej uczulonych osób swędzący obrzęk i zaczerwienienie skóry (bąbel i zaczerwienienie) wystąpią w ciągu 15 minut po prowokacji odpowiednim alergenem. Po 20 minutach roztwory alergenów zostaną wytarte, a brzegi bąbli zaznaczone długopisem. Przezroczysta taśma zostanie przyklejona do skóry w celu przeniesienia konturu bąbla na taśmę do płyt. Powierzchnia bąbli zostanie obliczona za pomocą cyfrowej planimetrii. W celu włączenia bąble o średnicy co najmniej 3 mm będą uważane za reakcje dodatnie.

   rozwiązania testowe:

   Dostępny w handlu ekstrakt z pyłku brzozy oraz zestaw alergenów pyłków drzew i traw, chwastów i bylin (Allergopharma, Wiedeń, Austria) zostaną użyte podczas wizyty przesiewowej i będą przechowywane zgodnie z instrukcjami producenta. Jako kontrole zostaną użyte sterylny 0,9% roztwór NaCl (kontrola negatywna) i histamina (kontrola pozytywna, Allergopharma, Wiedeń, Austria). Będą przechowywane zgodnie z zaleceniami producenta.

   SPT w prowadzeniu badania:

   Wizyta przesiewowa:

   Wykonany zostanie standardowy punktowy test skórny z komercyjnym ekstraktem z pyłku brzozy oraz panelem alergenów pyłków drzew i traw, chwastów i bylin (wszystkie Allergopharma, Wiedeń, Austria) stosowanych w rutynowej diagnostyce w poradni alergologicznej oddziału laryngologicznego w celu oceny profil uczulenia pacjenta podczas wizyty przesiewowej.

   Badania przesiewowe i wizyty N0, N5 - N11, S1-S4 Miareczkowany punktowy test skórny z ekstraktem z brzozy zostanie przeprowadzony przy rosnących rozcieńczeniach (rozcieńczenia będą zwiększane o współczynnik 3 aż do 1:60 000 (=11 stopni rozcieńczenia) w celu określenia najniższe stężenie, które wywołuje reakcję skórną. Testy skórne dla wszystkich rozcieńczeń zostaną wykonane w czterech powtórzeniach. Komercyjny roztwór kontroli pozytywnej (histamina) i kontrola ujemna zostaną wykonane w dwóch egzemplarzach.

   Środki ostrożności Ze względów bezpieczeństwa pacjenci będą monitorowani przez 30 minut po badaniu. Wszystkie badania będą wykonywane w Przychodni Oddziału Laryngologicznego, gdzie dostępne jest pełne wyposażenie ratunkowe.

   Pobieranie krwi i pomiar parametrów immunologicznych

   Próbki krwi zostaną pobrane podczas wizyty przesiewowej i podczas wszystkich wizyt badawczych przez nakłucie żyły łokciowej przed wykonaniem testu skórnego. Maksymalnie 60 ml na wizytę zostanie pobrane w postaci heparynizowanej (np. do testów wrażliwości na bazofile) lub do przygotowania surowicy (np. do oceny poziomu immunoglobulin całkowitych i specyficznych dla alergenu lub testu RBL). Fiolki z surowicą będą przetwarzane, a surowica będzie przechowywana w temperaturze -20°C. Swoiste dla alergenu IgE w próbkach krwi z wizyty przesiewowej zostaną zmierzone metodą CAP-FEIA w celu oceny swoistej dla alergenu klasy RAST pacjentów. Pomiar całkowitych, wolnych i swoistych dla alergenu surowiczych IgE, IgG, IgA i IgM zostanie przeprowadzony metodą CAP-FEIA, metodą pomiaru mikromacierzy lub testu ELISA. Pomiar zostanie przeprowadzony na koniec badania we wszystkich zebranych próbkach surowicy, aby zminimalizować zmienność między testami. Pomiar odpowiedzi bazofilów na alergen, fMLP i anty-IgE będzie wykonywany podczas każdej wizyty. Pokrótce, bazofile będą eksponowane na różne stężenia anty-IgE, fMLP lub rekombinowanych alergenów przez 15 minut, a następnie badane pod kątem ekspresji CD 63 i CD203c za pomocą cytometrii przepływowej. Alternatywnie, uwalnianie histaminy będzie określane za pomocą dostępnych w handlu zestawów do uwalniania histaminy.

   Testy ciążowe

   U pacjentek ciąża zostanie wykluczona za pomocą standardowego testu ciążowego z moczu. Badanie będzie wykonywane przed pierwszym testem skórnym na wizycie przesiewowej, a następnie raz w miesiącu.

   Pobieranie próbek z nosa

   Pobieranie wycinków z nosa będzie wykonywane podczas wszystkich wizyt. Podczas każdej wizyty próbki będą pobierane za pomocą nososorpcji FXi/PU (zawierającej syntetyczną matrycę absorpcyjną (SAM)) lub plastikowej łyżeczki o długości 10 cm (oba urządzenia firmy Hunt Developments, Wielka Brytania)

   Nasosorpcja przy użyciu FXi/PU (Hunt Developments, Wielka Brytania):

   Na wizualizacji urządzenie zostanie wprowadzone do jamy nosowej i umieszczone wzdłuż bocznej ściany przy małżowinie nosowej dolnej. Palec wskazujący pacjenta zostanie użyty do naciśnięcia zewnętrznych części chrząstki skrzydełkowej i bocznej nosa, aby utrzymać urządzenie na miejscu. Po 1 minucie urządzenia zostaną usunięte, a płyn zostanie odwirowany. Supernatant zostanie zamrożony w temperaturze -70°C do czasu dalszej analizy na obecność swoistych dla alergenu i całkowitych poziomów Ig, poziomów mediatorów i cytokin.

   Pobieranie próbek mRNA błony śluzowej Zostanie użyta łyżeczka nosowa o długości 10 cm. Podczas bezpośredniej wizualizacji kireta zostanie przyłożona do środkowo-dolnej części małżowiny nosowej dolnej. Kiretę dociska się do powierzchni błony śluzowej i przesuwa na zewnątrz 2-3 razy. Ten ruch zostanie powtórzony 2-3 razy, aby zapewnić dobre pobranie próbki. Wykazano, że ta kireta i technika nie powodują znacznego dyskomfortu u pacjentów, a zatem ma tę zaletę, że nie wymaga stosowania miejscowego środka znieczulającego. Po pobraniu Komórki zostaną poddane lizie w buforze Qiagen RLT i przechowywane w temperaturze -70°C do późniejszej analizy mRNA.

   4.9 Prowokacja donosowa

   Ekstrakt z pyłku brzozy (Allergopharma, Wiedeń, Austria) zostanie świeżo rozcieńczony w sterylnym 0,9% roztworze chlorku sodu i podany za pomocą pompki z dozownikiem. Alergen będzie podawany za pomocą pompki z dozownikiem, dostarczającej 15 μl na jedno zaciągnięcie do obu nozdrzy na wizycie N1, N2, N3. Jeśli po prowokacji u pacjenta występują objawy ze strony nosa lub oczu, zostanie podany azelastyna w aerozolu do nosa lub desloratadyna 5 mg.

   Procedura randomizacji

   Podczas wizyty N1 badania głównego pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch grup (wyciąg z pyłku brzozy lub placebo). Osoby badane zostaną zrandomizowane (stosunek 2:1 dla prowokacji do kontroli) przy użyciu internetowego programu do randomizacji „randomizer” (www.meduniwien.ac.at/randomizer), który jest utrzymywany w Instytucie Informatyki Medycznej, Statystyki i Dokumentacji w Medical Uniwersytet w Grazu, Graz, Austria. Wybrano stosunek 2:1, ponieważ oczekuje się, że wariancja pomiarów Ig i uzyskanych wielkości będzie większa w grupie prowokowanej ze względu na oczekiwane wyższe ogólne poziomy Ig, patrz również uwagi dotyczące wielkości próby w dalszej części tego dokumentu.

   Randomizacja zostanie przeprowadzona przez osobę, która nie bierze udziału w badaniu i nie ma kontaktu z pacjentami, aby zapewnić, że badanie będzie podwójnie ślepe.

   Produkty badawcze i badane leki

   Ekstrakt z pyłku brzozy:

   Ekstrakt z pyłku brzozy (Allergopharma, Wiedeń, Austria) zostanie użyty do prowokacji donosowej. Ekstrakt z pyłku brzozy zostanie dostarczony w postaci liofilizowanej i rozpuszczony w sterylnym 0,9% chlorku sodu. Zawartość Bet v 1 w ekstrakcie zostanie określona metodą immunoblottingu przy użyciu sond z przeciwciałami swoistymi dla Bet v 1. Na koniec ekstrakt zostanie rozcieńczony tak, aby końcowe stężenie Bet v 1 wyniosło 50 μg/ml, ponieważ stężenie to było wcześniej wykazano, że wywołuje zmiany w określonych poziomach IgE po prowokacji donosowej.

   Rozwiązania kontrolne:

   Roztwory kontrolne będą zawierały chlorek sodu 0,9% jako kontrola negatywna dla punktowego testu skórnego i jako placebo dla prowokacji donosowej. Histamina (Allergopharma, Wiedeń, Austria) zostanie użyta jako kontrola pozytywna dla punktowego testu skórnego. Będą przechowywane zgodnie z zaleceniami producenta.

   Leki towarzyszące

   Ogólny:

   Wszystkie dodatkowe leki przyjmowane przez uczestników przed przystąpieniem do badania lub w dowolnym momencie w trakcie badania są traktowane jako leki towarzyszące i zostaną udokumentowane w pliku danych źródłowych. Jednoczesne stosowanie leków powinno być ograniczone do minimum podczas badania, ale jeśli uzna się to za konieczne, można je podać, jeśli nie koliduje to z protokołem badania.

   Lek ratunkowy:

   Chociaż w tym badaniu zdarzenia anafilaktyczne są bardzo mało prawdopodobne, zawsze należy je brać pod uwagę jako możliwe. Dlatego kompletny zestaw ratunkowy będzie dostępny natychmiast w przypadku reakcji anafilaktycznych podczas SPT lub prowokacji donosowej. Ponadto, jeśli pacjent cierpi na objawy ze strony nosa i oczu po donosowej prowokacji, zostanie podany azelastyna w aerozolu do nosa i/lub desloratadyna 5 mg w celu złagodzenia objawów.

   Zakazane leki towarzyszące:

   Uczestnicy muszą pozostać bez leków zakłócających procedury badania przez cały czas trwania badania. Podczas tego badania niedozwolone jest jednoczesne stosowanie następujących leków:

   • Ogólnoustrojowe lub miejscowe kortykosteroidy
   • Inne leki immunosupresyjne
   • Leki przeciwhistaminowe lub kromoglikan disodu 3 dni przed wizytą
   • Ogólnoustrojowe lub donosowe leki adrenergiczne
   • Leki psychofarmakologiczne
   • Inhibitory ACE lub beta-blokery

   Zdarzenia niepożądane

   Zdarzenie niepożądane to każde zdarzenie podczas badania klinicznego, w tym współistniejąca choroba lub wypadek, które pogarsza samopoczucie uczestnika; może również przybrać formę nieprawidłowej wartości laboratoryjnej. Termin zdarzenie niepożądane nie oznacza związku przyczynowego z badanym leczeniem.

   Wszyscy uczestnicy, u których wystąpią zdarzenia niepożądane – niezależnie od tego, czy zostaną uznane za związane ze stosowaniem badanego leku, czy nie – będą monitorowani do czasu ustąpienia objawów i powrotu nieprawidłowych wartości laboratoryjnych do wartości wyjściowych lub do czasu zadowalającego wyjaśnienia zaobserwowanych zmian lub do śmierci , w takim przypadku zostanie dostarczony pełny raport patologiczny sporządzony przez wykwalifikowanego patologa. Wszystkie ustalenia należy zgłosić na stronie „zdarzenie niepożądane” w formularzu dokumentacji przypadku.

   Wszystkie zdarzenia niepożądane będą zgłaszane i dokumentowane w sposób opisany poniżej. Zdarzenia niepożądane dzielą się na kategorie „poważne” i „niepoważne”. Określa to procedurę, którą należy zastosować, aby zgłosić/udokumentować zdarzenie niepożądane.

   Definicja poważnych i innych niż poważne zdarzenia niepożądane

   Poważnym zdarzeniem niepożądanym jest:

   • Każde zdarzenie, które jest śmiertelne lub zagrażające życiu
   • Dowolne zdarzenie, które trwale wyłącza
   • Każde zdarzenie wymagające lub przedłużające hospitalizację
   • Każde zdarzenie związane z rakiem, wadą wrodzoną lub występujące w wyniku przedawkowania (zastosowanie dawki większej niż zalecana).

   Zdarzenia niepożądane, które nie mieszczą się w tych kategoriach, są określane jako niepoważne.

   Ocena ciężkości AE

   Niezależnie od klasyfikacji zdarzenia niepożądanego jako poważnego lub nieciężkiego (patrz wyżej), jego ciężkość należy ocenić jako łagodną, ​​umiarkowaną lub ciężką, wyłącznie na podstawie kryteriów medycznych:

   Łagodny = nie koliduje z rutynowymi czynnościami, akceptowalny Umiarkowany = koliduje z rutynowymi czynnościami Poważny = niemożliwy do wykonania rutynowych czynności, uznany przez lekarza za niedopuszczalny, wymagający leczenia, wymagający przerwania badania lub ma efekt szczątkowy.

   Należy zauważyć, że poważne zdarzenie niepożądane nie musi mieć poważnego charakteru. Niezależnie od ciężkości, wszystkie poważne zdarzenia niepożądane muszą być zgłaszane w sposób przedstawiony poniżej.

   Zgłaszanie/dokumentowanie zdarzeń niepożądanych

   Zdarzenia niepożądane są zbierane poprzez spontaniczne zgłaszanie.

   Zgłaszanie/dokumentowanie poważnych zdarzeń niepożądanych

   Wszystkie poważne zdarzenia niepożądane, które wystąpiły podczas tego badania, niezależnie od tego, czy są uważane za związane z badanym lekiem, czy nie, muszą być udokumentowane na stronie „Zdarzenie niepożądane” w formularzu zapisu przypadku.

   Należy sporządzić sprawozdanie uzupełniające zawierające wszystkie nowe informacje uzyskane w związku z poważnym zdarzeniem, które zostanie zebrane.

   Na żądanie badacz przedłoży komisji etycznej kopie wszystkich tych raportów. W razie potrzeby śledczy poinformują władze.

   Zgłaszanie/dokumentowanie zdarzeń niepożądanych innych niż poważne

   Należy je udokumentować na stronie „Zdarzenie niepożądane” w formularzu dokumentacji przypadku.

   Analiza statystyczna

   Ponieważ jest to badanie pilotażowe, przeprowadzone analizy mają charakter eksploracyjny i generujący hipotezy.

   Charakterystyka pacjenta i zmienne wynikowe zostaną opisane poprzez obliczenie maksimum, minimum, mediany, średniej i odchylenia standardowego dla zmiennych metrycznych oraz bezwzględnych i względnych częstości dla zmiennych kategorycznych.

   Aby przeanalizować trajektorie czasowe poziomów IgE i innych zmiennych wynikowych, statystyki opisowe, jak również 95% przedziały ufności dla średniej zostaną obliczone dla każdego punktu czasowego i każdej grupy leczenia oddzielnie. Aby uwzględnić niejednorodne poziomy wyjściowe u pacjentów, obserwowane wyniki dla każdego pacjenta będą standaryzowane przez odpowiednie wartości wyjściowe dla tych analiz. Ponadto dla każdego punktu czasowego zostaną obliczone średnie różnice między grupami i odpowiednio 95% przedziały ufności. Dla graficznej ilustracji zostaną wykreślone indywidualne trajektorie każdego pacjenta.

   Dane obserwowane w punktowym teście skórnym składają się z serii dawek alergenu i wynikowych pomiarów powierzchni. Na podstawie wstępnych danych uzyskanych od ośmiu pacjentów w poprzednim badaniu stwierdzono, że model wykładniczy typu Area = A*(1-exp(-λ Dawka) odpowiednio opisuje zależność dawka-odpowiedź obserwowaną w skórnym teście punktowym. Model będzie dopasowany do każdego punktu czasowego w każdej grupie przy użyciu nieliniowego algorytmu najmniejszych kwadratów. Na podstawie tych modeli podany zostanie współczynnik odpowiedzi λ, powierzchnia plateau A i dawka skuteczna wynosząca 50% wraz z 95% przedziałami ufności.

   Jeśli brakuje wartości, cała analiza zostanie przeprowadzona na podstawie dostępnych przypadków.

   Uwagi dotyczące wielkości próbki:

   Biorąc pod uwagę eksploracyjny charakter badania, rozważania dotyczące wielkości próby opierają się na precyzji oszacowań parametrów. Głównym celem jest analiza poziomów IgE w czasie. Dane z poprzedniego badania wskazują na względny wzrost IgE anty-Bet v 1 cztery tygodnie po prowokacji donosowej Bet v 1 o średni współczynnik 1,4 i odchylenie standardowe około 0,5 między pacjentami. W przypadku antygenu kontrolnego średni współczynnik wynosił 1,04 przy odchyleniu standardowym około 0,25. Maksymalną precyzję statystyczną porównania wartości średnich między dwiema grupami uzyskuje się, gdy stosunek alokacji jest proporcjonalny do stosunku odchyleń standardowych, który wynosi 2:1 na podstawie danych poprzednich. Przy powyższych założeniach dotyczących wielkości efektów i odchyleń standardowych, całkowita wielkość próby 30 (20:10) zapewni 95% przedziały ufności z szerokością połówkową około 0,2 w każdej grupie. Oczekiwana szerokość połówkowa 95% przedziału ufności dla średniej różnicy między grupami wynosi 0,28. (Odpowiedni test t dla dwóch próbek miałby moc 80% do wykrycia średniej różnicy 0,4 na poziomie istotności 5%). Wstępne dane dotyczące analizy punktowego testu skórnego sugerują, że przy próbie liczącej 20 osób szerokość połówkowa 95% przedziałów ufności dla 50% skutecznej dawki będzie w przybliżeniu 0,25 razy większa od 50% skutecznej dawki, co uważa się za jako wystarczająca precyzja dla tego badania pilotażowego. Proszę zapoznać się z załącznikiem w celu przedstawienia graficznego

   Aspekty etyczne i prawne

   Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wymogami prawnymi i GCP. Zostanie przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej (1964), uwzględniając aktualne rewizje.

   Świadoma zgoda podmiotu

   Uczestnik przed dopuszczeniem do badania musi wyrazić zgodę na udział po wyjaśnieniu w zrozumiałej dla niego formie charakteru, zakresu i możliwych konsekwencji badania klinicznego. Podmiot musi wyrazić zgodę na piśmie. Podpis badacza potwierdzi zgodę osoby badanej. Pacjent może wycofać zgodę, nawet bez zgłaszania uwag, w dowolnym momencie i bez negatywnych konsekwencji dla swojej przyszłej opieki medycznej.

   Potwierdzenie/zatwierdzenie badania

   Przed rozpoczęciem badania protokół badania zostanie przedłożony Komisji Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu i szpitala ogólnego w Wiedniu (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Wiedeń, Austria).

   Ubezpieczenie

   Wszystkie osoby biorące udział w tym badaniu będą ubezpieczone w Zürich Insurance Company (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Wiedeń, Tel. +43 50 1255 1255; numer ubezpieczenia: 07229622-2).

   Poufność

   Nazwiska wszystkich badanych będą utrzymywane w tajemnicy w aktach śledczych. Osoby badane będą identyfikowane w całej dokumentacji i ocenie na podstawie liczby przydzielonej im podczas badania. Osoby badane zostaną poinformowane, że wszystkie wyniki badań będą przechowywane i przetwarzane w ścisłej tajemnicy.

   Dokumentacja i wykorzystanie wyników badań

   Dokumentacja wyników badań

   Wszystkie wyniki zebrane podczas badania zostaną zebrane w pliku danych źródłowych, a następnie przeniesione do formularzy opisów przypadków (CRF). Wszystkie wpisy na kartach akt sprawy będą czytelne, czarnym lub niebieskim atramentem. W przypadku wprowadzenia poprawek do wpisów w formularzu akt sprawy, słowa lub cyfry zostaną otoczone i przekreślone pojedynczą kreską. Obok starego wpisu i daty zostanie wpisana poprawna wartość, a poprawka zostanie zaparafowana. Wpisów błędnych nie wolno zakrywać płynem korygującym ani zamazywać lub w jakikolwiek sposób czynić nieczytelnymi. Wypełnione CRF zostaną podpisane przez badacza. CRF zostaną zakończone natychmiast po egzaminie końcowym. Dokumentacja medyczna, na której opiera się CRF, będzie przechowywana przez co najmniej 15 lat.

   Wykorzystanie wyników badań

   Wyniki tego badania zostaną opublikowane przez badaczy w czasopiśmie naukowym i zaprezentowane na spotkaniach naukowych. Manuskrypt zostanie rozesłany do wszystkich współbadaczy przed złożeniem.