Alterações nas respostas imunes adaptativas e nas respostas das células efetoras após a exposição nasal ao alérgeno - um estudo piloto

Racional do Estudo

Estudos anteriores sobre a dinâmica das respostas clínicas e imunológicas in vivo ao alérgeno nasal focaram em parâmetros específicos, mas não abordaram a cinética da interação entre os diferentes fatores (ou seja, níveis de IgE específicos para alérgenos, IgE local e produção de mediadores, sensibilidade a basófilos, sensibilidade cutânea). Os investigadores, portanto, propõem um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, no qual os pesquisadores desafiam os pacientes por via intranasal com extrato de alérgenos e, em seguida, monitoram de perto as respostas imunológicas clínicas e imunológicas durante um período de 4 meses. Depois disso, mais 4 visitas ocorrerão antes e depois da temporada de bétulas.

Os investigadores observarão as respostas imunes de fase imediata e tardia ao desafio nasal com extrato de pólen de bétula fora da estação do pólen. Os participantes do estudo serão inicialmente submetidos a 3 dias consecutivos de provocação de alérgenos nasais e, em seguida, serão acompanhados de perto por um período de 1 ano. Para avaliar a resposta clínica à exposição ao alérgeno, os investigadores farão uso do teste de picada na pele (SPT), escore total de sintomas nasais (TNSS), endoscopia nasal e medidor de pico de fluxo nasal inspiratório (PNIF). Para avaliar as respostas imunológicas, amostras incluindo sangue, amostras da mucosa nasal e secreções nasais serão coletadas.

Design de estudo

Neste estudo de centro único, randomizado, controlado por placebo, duplo-cego, um total de 36 (6 para um pré-estudo) pacientes serão recrutados para este estudo de forma voluntária e serão randomizados para receber um desafio nasal com bétula extrato de pólen ou placebo. A randomização será estratificada de acordo com os níveis de IgE específicos de Bet v 1 para permitir uma distribuição igual em ambos os grupos. 30 Os participantes do estudo receberão provocação nasal fora da estação do pólen de bétula com extrato de pólen de bétula ou placebo em três dias consecutivos e, posteriormente, serão acompanhados regularmente por até quatro meses.

Inicialmente, antes do estudo em 30 pacientes, 6 indivíduos alérgicos ao pólen de bétula serão submetidos a um breve protocolo para garantir que

1. A concentração do alérgeno usada para provocação nasal é suficiente para provocar um aumento de anticorpos IgE
2. Que as titulações do teste cutâneo são adequadas

3. Que o momento de tirar as secreções nasais para determinação dos mediadores é adequado.

   Caso os resultados desses 6 pacientes revelem que a concentração do alérgeno nasal, as titulações dos testes cutâneos ou o tempo das secreções nasais não são adequados, uma alteração será submetida ao comitê de ética.

   O protocolo abreviado incluirá 5 visitas:

   • visita de triagem completa
   • visita completa N1
   • visita N2 sem amostragem de sangue e sem amostragem nasal
   • visita N3 sem amostragem de sangue e sem amostragem nasal
   • visita completa N7

   Visita de Triagem

   Procedimento

   • Assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Versão 2.1. para estudo inicial com protocolo curto, Versão 1.8 (atualizado para extensão) para estudo principal)
   • Atribuição do número de triagem
   • Dados demográficos
   • Histórico de alergia
   • Avaliação dos Critérios de Inclusão e Exclusão
   • Teste de gravidez para mulheres se precisar de SPT
   • Histórico médico
   • Medicação concomitante
   • rinoscopia anterior
   • SPT padrão com extrato comercial de: avelã, freixo, mistura de ervas, ambrósia, artemísia, D. pteronyssinus, D. farina, pelos de gato e cachorro, alternaria, cladosporium, histamina e controle negativo
   • Teste cutâneo titulado com extrato comercial de pólen de bétula
   • Amostragem de sangue (max 60ml de sangue heparinizado e soro) - Uma parte da amostra de sangue será enviada diretamente ao laboratório para análise de ativação de basófilos, IgE total e IgE específica para alérgenos relevantes. Do restante do sangue, o RNA será preparado e armazenado a -80°C e o soro será separado e armazenado a -20°C
   • amostragem nasal (lavagem nasal, amostragem de cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)

   Visita N0

   Requisitos relativos ao tempo: A visita N0 está agendada entre 2 semanas e 4 dias antes da visita N1. Isso é apenas para pacientes que foram rastreados mais de 3 semanas antes da visita N1

   Procedimento:

   • Amostra de sangue
   • Coleta de espécime nasal (lavagem, amostragem de cureta mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • SPT titulado
   • PNIF
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite N1

   Procedimento:

   • Reavaliação dos Critérios de Inclusão e Exclusão (resultados de IgE específicos para alérgenos)
   • Randomização: Os indivíduos receberão um número de tratamento
   • Amostragem de sangue de linha de base
   • Coleta de amostras nasais de linha de base (lavagem, amostragem de mucosa nasal e amostragem de secreção nasal)
   • Pontuação TNSS basal
   • Registro de evento adverso (EA)
   • Medicação concomitante
   • PNIF dado aos pacientes e explicação/demonstração de como funciona. Os pacientes receberão um diário em papel para acompanhar os valores diários do PNIF (de N1 a N5). Este laticínio também será usado para registrar as pontuações diárias do TNSS (N4-N5).
   • Teste de gravidez
   • em. administração de extrato de pólen de bétula ou placebo
   • Documentação dos sintomas imediatamente após a provocação
   • Sangue, PNIF, amostragem nasal (lavagem nasal, amostragem de cureta mucosa e amostragem de secreção nasal) e pontuação TNSS, 20min, 40min, 1h, 2h, 4h, 20-24h após a administração do extrato de pólen de bétula (ponto de tempo de 20-24 horas será realizado na visita N2).
   • Amostragem nasal, pontuação PNIF e TNSS aos 10 minutos, 3 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas após a administração do extrato de pólen de bétula
   • SPT titulado
   • administração de medicação de resgate se necessário (spray nasal de azelastina, desloratadina 5mg)

   Visite N2

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N2 está marcada para o dia seguinte à visita N1

   Procedimento:

   • Sangue, PNIF, amostragem nasal (lavagem, amostragem de cureta mucosa e amostragem de secreção nasal) e pontuação TNSS (ponto de tempo de 20-24 horas após a administração de extrato de pólen de bétula em N1).
   • gravação AE
   • Medicação concomitante
   • em. administração de extrato de pólen de bétula ou placebo seguido de um período de observação de 2 horas
   • Documentação dos sintomas imediatamente após a provocação
   • administração de medicação de resgate se necessário (spray nasal de azelastina, desloratadina 5mg)
   • Nota: nos 6 indivíduos iniciais do estudo, não serão realizadas amostras nasais e de sangue

   Visite N3

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N3 está marcada para o dia seguinte à visita N2

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue antes da provocação
   • Coleta de espécime nasal antes da provocação (lavagem, amostragem de cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • Pontuação TNSS antes da provocação
   • SPT titulado
   • Registro de evento adverso (EA)
   • Medicação concomitante
   • em. administração de extrato de pólen de bétula ou placebo
   • Documentação dos sintomas imediatamente após a provocação
   • Sangue, PNIF, amostragem nasal (lavagem, amostragem de cureta mucosa e amostragem de secreção nasal) e pontuação TNSS 20min, 40min, 1hr, 2hr, 4hr, 20-24hr e após a administração de extrato de pólen de bétula (ponto de tempo de 20-24 horas será realizado em visita N4).
   • Amostragem nasal, pontuação PNIF e TNSS aos 10 minutos, 3 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas após a administração do extrato de pólen de bétula
   • Administração de medicação de resgate, se necessário (spray nasal de azelastina, desloratadina 5mg)
   • Nota: nos 6 indivíduos iniciais do estudo, não serão realizadas amostras nasais e de sangue

   Visite N4

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N4 está marcada para o dia seguinte à visita N3

   Procedimento:

   • Sangue, PNIF, amostragem nasal (lavagem, amostragem de cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal) e escore TNSS em 20-24 horas após a administração do extrato de pólen de bétula.

   Visite N5

   A visita N5 está agendada 14 ±4 dias após a visita N4:

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • Pontuação TNSS
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês
   • Recolha de diário em papel da Visita N1 a N5

   Visite N6

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N6 está agendada 14 ± 4 dias após a visita N5

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite N7

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N7 está agendada 14 ± 4 dias após a visita N6

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite N8

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N8 está agendada 14 ± 4 dias após a visita N7

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • pontuação
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite N9

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N9 está agendada 14 ± 4 dias após a visita N8

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite N10

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N9 está agendada 14 ± 4 dias após a visita N9

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visita N11 - Visita Final do Componente de Provocação Nasal

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita N11 está agendada 28 ± 4 dias após a visita N10

   Procedimento:

   • Sangue para parâmetros imunológicos e amostragem nasal (lavagem, cureta de mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF
   • SPT titulado
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visita S1 (Extensão - Aprovado pelo Comitê de Ética da MUW em 11 de fevereiro de 2019)

   Requisitos relativos ao tempo: A visita S1 é agendada 4 semanas antes do início previsto da temporada de bétulas (+/- 7 dias)

   Procedimento:

   • Pólen em papel e diário PNIF explicados aos pacientes e solicitados a preencher diariamente durante a estação das bétulas
   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • SPT titulado
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite S2

   Requisitos relativos ao tempo: A visita S2 está programada 4 semanas após o final da temporada de bétulas (+/- 7 dias)

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • Diário de coleção de papel
   • PNIF observado
   • SPT titulado
   • Pontuação TNSS na visita
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite S3

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita S3 está agendada 4 semanas após a visita S2 - (+/- 7 dias)

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF observado
   • SPT titulado
   • Pontuação TNSS na visita
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês

   Visite S4 e Fim do Estudo

   Requisitos relativos ao tempo:

   A visita S4 está agendada 1 ano após o início de todo o estudo (1 ano após a visita N0) +/- 7 dias

   Procedimento:

   • Amostragem de sangue e nasal (lavagem, cureta da mucosa e amostragem de secreção nasal)
   • PNIF observado
   • SPT titulado
   • Pontuação TNSS na visita
   • gravação AE
   • Teste de gravidez para mulheres se o último teste foi há mais de um mês
   • Fim do estudo

   Descrições dos procedimentos do estudo

   Histórico médico dos pacientes, dados demográficos, medicação concomitante Os pacientes serão questionados sobre seu histórico médico, incluindo dados demográficos e medicação concomitante, seus sintomas alérgicos, incluindo intensidade e duração, e seu histórico de medicação alérgica.

   Histórico de alergia e escore TNSS

   Os pacientes serão questionados sobre a ocorrência de espirros, rinorréia, prurido nasal, congestão nasal e qualidade do sono e para classificar cada sintoma em cada visita e manter um registro em casa. Eles usarão o seguinte método de pontuação de sintomas: 0 = ausente; 1 = leve - presente, mas facilmente tolerado; 2 = moderado - presente, o sintoma incomoda, mas não interfere nas atividades de vida diária; 3 = grave - o sintoma é difícil de tolerar e está interferindo nas atividades da vida diária (24). Além disso, haverá uma escala analógica visual da carga total de doenças no formulário.

   rinoscopia anterior

   A rinoscopia anterior será realizada uma vez durante a visita de triagem para excluir variações anatômicas (por exemplo, desvio septal) ou alterações patológicas (ex. pólipos nasais). Será realizada com o uso de espéculo com o paciente sentado com a cabeça ligeiramente para trás.

   Medidor de pico de fluxo nasal inspiratório (PNIF)

   A portabilidade e facilidade do PNIF oferece uma oportunidade única para obter medições objetivas enquanto os pacientes estão em casa. Também foi recentemente validado como uma ferramenta de estudo durante o desafio nasal com alérgenos.

   Procedimento:

   Na visita 1, os pacientes serão treinados sobre como usar o dispositivo PNIF (In-check, medidor de fluxo inspiratório) e receberão um para levar para casa até N5. O PNIF usa um tubo de diâmetro variável calibrado diretamente em litros por minuto junto com um anel indicador de baixa inércia. A posição do anel após uma manobra inspiratória indica o fluxo máximo alcançado. O dispositivo funciona quando um paciente inala pela boca ou nariz, isso faz com que o ar seja aspirado pelo medidor e um cursor se mova ao longo da escala para indicar a velocidade da inalação. A taxa de fluxo alcançada pode ser observada verificando a posição do cursor em relação à escala calibrada.

   PNIF na condução do estudo:

   O PNIF será dado aos participantes do estudo para levarem para casa para que possam manter um laticínio diário ou semanal (dependendo da fase do estudo) de seu fluxo de ar nasal. Eles também serão solicitados a trazê-los a todas as visitas do estudo para que as medições de PNIF observadas possam ser feitas.

   Teste cutâneo

   4.5.1 Procedimento: Os alérgenos são inseridos na derme do antebraço, picando suavemente a pele através de uma gota (20ul) de uma solução contendo alérgenos com uma lanceta estéril com pelo menos 2 cm entre cada ponto de aplicação individual. Solução de cloreto de sódio a 0,9% será utilizada como controle negativo e histamina como controle positivo. Em indivíduos previamente sensibilizados, ocorrerá inchaço pruriginoso e vermelhidão da pele (pápula e reação eruptiva) dentro de 15 minutos após o desafio com o respectivo alérgeno. Após 20 minutos, as soluções de alérgenos serão removidas e as margens das pápulas serão traçadas com uma caneta esferográfica. Fita transparente será colada na pele a fim de transferir o contorno da pápula para a fita para os registros. A superfície das pápulas será calculada por planimetria digital. Para inclusão, pápulas de pelo menos 3 mm de diâmetro serão consideradas reações positivas.

   Soluções de teste:

   Extrato de pólen de bétula comercialmente disponível e um painel de pólen de árvores e gramíneas, ervas daninhas e alérgenos perenes (Allergopharma, Viena, Áustria) serão usados ​​na visita de triagem e serão armazenados de acordo com as instruções do fabricante. Como controles, serão utilizadas solução estéril de NaCl 0,9% (controle negativo) e histamina (controle positivo, Allergopharma, Viena, Áustria). Eles serão armazenados de acordo com as instruções do fabricante.

   SPT na condução do estudo:

   Visita de Triagem:

   Um teste cutâneo padrão com extrato de pólen de bétula comercial e um painel de pólen de árvores e gramíneas, ervas daninhas e alérgenos perenes (todos Allergopharma, Viena, Áustria), conforme usado no diagnóstico de rotina na clínica de alergia do departamento de otorrinolaringologia, será realizado para avaliar a perfil de sensibilização do paciente na consulta de triagem.

   Triagem e visitas N0, N5 - N11, S1-S4 Um teste cutâneo titulado para extrato de bétula será realizado com diluições crescentes (as diluições serão aumentadas por um fator de 3 até 1:60.000 (=11 etapas de diluição) para determinar a concentração mais baixa que provoca uma resposta da pele. Os testes cutâneos para todas as diluições serão feitos em quadruplicata. A solução de controle positivo comercial (histamina) e o controle negativo serão feitos em duplicata.

   Precauções de segurança Como precaução de segurança, os pacientes serão monitorados por 30 minutos após o teste. Todas as investigações serão feitas no Ambulatório do Departamento de Otorrinolaringologia, onde está disponível todo o equipamento de emergência.

   Amostragem de sangue e medição de parâmetros imunológicos

   Amostras de sangue serão coletadas na visita de triagem e em todas as visitas do estudo por punção da veia antecubital antes do teste cutâneo. Um máximo de 60 ml por visita será tomado heparinizado (por exemplo, para ensaios de sensibilidade a basófilos) ou para a preparação de soro (por exemplo, para avaliação dos níveis de imunoglobulina total e específica do alergênio ou ensaio de RBL). Os frascos de soro serão processados ​​e o soro armazenado a -20°C. A IgE específica do alérgeno das amostras de sangue da visita de triagem será medida por CAP-FEIA para avaliar a classe RAST específica do alérgeno dos pacientes. A medição de IgE, IgG, IgA e IgM sérica total, livre e específica para alérgenos será realizada por CAP-FEIA, por medição de microarray ou ELISA. A medição será realizada no final do estudo em todas as amostras de soro coletadas para minimizar a variação interensaio. A medição das respostas dos basófilos ao alérgeno, fMLP e anti-IgE será realizada em cada visita. Resumidamente, os basófilos serão expostos a várias concentrações de anti-IgE, fMLP ou alérgenos recombinantes por 15 minutos e então examinados quanto à expressão de CD 63 e CD203c por meio de citometria de fluxo. Alternativamente, a liberação de histamina será determinada por kits de liberação de histamina disponíveis comercialmente.

   teste de gravidez

   Em pacientes do sexo feminino, a gravidez será excluída com um teste padrão de gravidez na urina. O teste será realizado antes do primeiro teste cutâneo por picada na visita de triagem e depois uma vez por mês.

   Coleta de espécimes nasais

   A coleta de espécimes nasais será realizada em todas as visitas. Para cada visita, as amostras serão coletadas usando FXi/PU de nasossorção (contendo uma matriz absortiva sintética (SAM)) ou uma cureta plástica de 10 cm de comprimento (ambos os dispositivos da Hunt Developments, Reino Unido)

   Nasoadsorção usando FXi/PU (Hunt Developments, Reino Unido):

   Sob visualização, o dispositivo será inserido na cavidade nasal e colocado ao longo da parede lateral contra o corneto inferior. O dedo indicador do paciente será usado para pressionar os aspectos externos das cartilagens nasais alares e laterais para manter o dispositivo no lugar. Após 1 minuto, os dispositivos serão removidos e o fluido será extraído por centrifugação. O sobrenadante será congelado a -70°C até uma análise mais aprofundada quanto à presença de níveis de Ig totais e específicos do alérgeno, níveis de mediadores e citocinas.

   Amostragem de mRNA da mucosa Será utilizada uma cureta nasal de 10 cm. Sob visualização direta, a cureta será posicionada contra a porção médio-inferior do corneto inferior. A cureta será pressionada contra a superfície mucosa movida para fora 2-3 vezes. Este movimento será repetido 2-3 vezes para garantir uma boa coleta de amostra. Essa cureta e essa técnica demonstraram não causar desconforto significativo aos pacientes e, portanto, têm a vantagem de não exigir anestesia local. Após a coleta, as células serão lisadas em tampão Qiagen RLT e armazenadas a -70C para posterior análise de mRNA.

   4.9 Desafio intranasal

   Extrato de pólen de bétula (Allergopharma, Viena, Áustria) será diluído na hora em solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% e será administrado usando uma bomba dosadora. O alérgeno será administrado usando uma bomba medida fornecendo 15 μl por sopro para ambas as narinas na visita N1, N2, N3. Se o paciente apresentar sintomas nasais ou oculares após o desafio, será fornecido spray nasal de azelastina ou desloratadina 5 mg.

   Procedimento de Randomização

   Na visita N1 do estudo principal, os pacientes serão randomizados para um dos dois grupos (extrato de pólen de bétula ou placebo). Os sujeitos do estudo serão randomizados (proporção 2:1 para provocação versus controle) usando o programa de randomização online "randomizer" (www.meduniwien.ac.at/randomizer), que é mantido no Institute for Medical Informatics, Statistics and Documentation at Medical Universidade de Graz, Graz, Áustria. A proporção de 2:1 é escolhida porque se espera que a variação das medições de Ig e das quantidades derivadas seja maior no grupo de provocação devido aos níveis gerais de Ig maiores esperados. Consulte também as considerações sobre o tamanho da amostra mais adiante neste documento.

   A randomização será realizada por uma pessoa que não esteja envolvida no estudo e não tenha contato com os pacientes para garantir que o estudo seja duplo-cego.

   Produtos em investigação e medicamentos em estudo

   Extrato de pólen de bétula:

   Extrato de pólen de bétula (Allergopharma, Viena, Áustria) será usado para desafio intranasal. O extrato de pólen de bétula chegará liofilizado e será dissolvido em cloreto de sódio 0,9% estéril. O conteúdo de Bet v 1 no extrato será determinado por imunoblotting usando sondas de anticorpos específicas para Bet v 1. Por fim, o extrato será diluído de forma que a concentração final de Bet v 1 seja de 50 μg/ml como esta concentração foi previamente demonstrou provocar alterações nos níveis específicos de IgE após provocação nasal.

   Soluções de controle:

   As soluções controle conterão cloreto de sódio 0,9% como controle negativo para teste cutâneo por picada e como placebo para provocação intranasal. A histamina (Allergopharma, Viena, Áustria) será utilizada como controle positivo para o teste cutâneo em picada. Eles serão armazenados de acordo com as instruções do fabricante.

   Medicação concomitante

   Em geral:

   Todos os medicamentos adicionais tomados pelos sujeitos na entrada no estudo ou a qualquer momento durante o estudo são considerados medicamentos concomitantes e serão documentados no Arquivo de Dados de Origem. Os medicamentos concomitantes devem ser reduzidos ao mínimo durante o estudo, mas, se considerados necessários, podem ser administrados se não interferirem no protocolo do estudo.

   Medicação de resgate:

   Embora eventos anafiláticos sejam muito improváveis ​​neste estudo, eles sempre devem ser considerados possíveis. Portanto, um kit de emergência completo estará disponível imediatamente em caso de reações anafiláticas no SPT ou provocação nasal. Além disso, se o paciente apresentar sintomas nasais e oculares após o desafio intranasal, azelastina spray nasal e/ou desloratadina 5 mg serão administrados para melhorar os sintomas.

   Medicação concomitante proibida:

   Os indivíduos devem permanecer sem medicamentos que interfiram nos procedimentos do estudo durante o estudo. Os seguintes tratamentos concomitantes não são permitidos durante este estudo:

   • Corticosteroides sistêmicos ou tópicos
   • Outros medicamentos imunossupressores
   • Anti-histamínicos ou cromoglicato dissódico 3 dias antes das consultas
   • Drogas adrenérgicas sistêmicas ou intranasais
   • Drogas psicofarmacológicas
   • Inibidores da ECA ou betabloqueadores

   Eventos adversos

   Um evento adverso é qualquer evento durante um estudo clínico, incluindo doença intercorrente ou acidente, que prejudica o bem-estar do sujeito; também pode assumir a forma de um valor laboratorial anormal. O termo evento adverso não implica uma relação causal com o tratamento do estudo.

   Todos os indivíduos que apresentarem eventos adversos - considerados ou não associados ao uso do tratamento do estudo - serão monitorados até que os sintomas desapareçam e qualquer valor laboratorial anormal tenha retornado à linha de base, ou até que haja uma explicação satisfatória para as alterações observadas, ou até a morte , caso em que será fornecido um relatório patológico completo de um patologista qualificado. Todos os achados devem ser relatados em uma página de "evento adverso" no formulário de registro do caso.

   Todos os eventos adversos serão relatados e documentados conforme descrito abaixo. Os eventos adversos são divididos nas categorias "graves" e "não graves". Isso determina o procedimento que deve ser usado para relatar/documentar o evento adverso.

   Definição de eventos adversos graves e não graves

   Um evento adverso grave é:

   • Qualquer evento que seja fatal ou com risco de vida
   • Qualquer evento que esteja desativando permanentemente
   • Qualquer evento que requeira ou prolongue a hospitalização
   • Qualquer evento que envolva câncer, anomalia congênita ou ocorra como resultado de superdosagem (aplicação de mais do que a dose estipulada).

   Os eventos adversos que não se enquadram nessas categorias são definidos como não graves.

   Avaliação da gravidade do EA

   Independentemente da classificação de um evento adverso como grave ou não grave (ver acima), sua gravidade deve ser avaliada como leve, moderada ou grave, de acordo apenas com critérios médicos:

   Leve = não interfere nas atividades rotineiras, aceitável Moderado = interfere nas atividades rotineiras Grave = impossibilidade de realizar atividades rotineiras, considerado inaceitável pelo médico, requer tratamento, requer interrupção do estudo ou tem efeito residual.

   Deve-se notar que um evento adverso grave não precisa ser de natureza grave. Independentemente da gravidade, todos os eventos adversos graves devem ser relatados conforme abaixo.

   Notificação/documentação de eventos adversos

   Os eventos adversos são coletados por notificação espontânea.

   Notificação/documentação de eventos adversos graves

   Todos os eventos adversos graves que ocorrerem durante este estudo, sejam eles considerados associados à medicação do estudo ou não, devem ser documentados na página "Evento adverso" no formulário de registro de caso.

   Um relatório de acompanhamento incluindo todas as novas informações obtidas sobre o evento grave deve ser preparado e será coletado.

   O investigador enviará, mediante solicitação, cópias de todos esses relatórios ao comitê de ética. Sempre que necessário, os investigadores informarão as autoridades.

   Notificação/documentação de eventos adversos não graves

   Estes devem ser documentados na página "Evento adverso" no formulário de registro do caso.

   Análise estatística

   Por se tratar de um estudo piloto, as análises realizadas são consideradas exploratórias e geradoras de hipóteses.

   As características do paciente e as variáveis ​​de resultado serão descritas por meio do cálculo de máximo, mínimo, mediana, média e desvio padrão para variáveis ​​métricas e frequências absolutas e relativas para variáveis ​​categóricas.

   Para analisar as trajetórias temporais dos níveis de IgE e outras variáveis ​​de resultado, estatísticas descritivas, bem como intervalos de confiança de 95% para a média, serão calculados para cada ponto no tempo e cada grupo de tratamento separadamente. Para contabilizar os níveis basais heterogêneos entre os pacientes, os resultados observados para cada paciente serão padronizados pelos respectivos valores basais para essas análises. Além disso, as diferenças médias entre os grupos e os respectivos intervalos de confiança de 95% serão calculados para cada ponto de tempo. Para fins de ilustração gráfica, serão traçadas as trajetórias individuais de cada paciente.

   Os dados observados no teste cutâneo consistem em uma série de doses de alérgenos e as medições de área resultantes. Com base em dados preliminares de oito pacientes no estudo anterior, um modelo exponencial do tipo Área = A*(1-exp(-λ Dose) foi encontrado para descrever adequadamente a relação dose-resposta observada no teste cutâneo em picada. O modelo será ajustado para cada ponto de tempo em cada grupo usando um algoritmo de mínimos quadrados não linear. A partir desses modelos, a taxa de resposta λ, a área de platô A e a dose efetiva de 50% serão relatadas juntamente com intervalos de confiança de 95%.

   Se houver valores ausentes, todas as análises serão feitas com base no caso disponível.

   Considerações sobre o tamanho da amostra:

   Dada a natureza exploratória do estudo, as considerações sobre o tamanho da amostra são baseadas na precisão das estimativas dos parâmetros. O objetivo primário é a análise dos níveis de IgE ao longo do tempo. Dados de um estudo anterior mostram um aumento relativo de anti-Bet v 1 IgE quatro semanas após a provocação nasal com Bet v 1 por um fator médio de 1,4 e um desvio padrão de aproximadamente 0,5 entre os pacientes. Com um antígeno de controle, o fator médio foi de 1,04 com um desvio padrão de aproximadamente 0,25. A precisão estatística máxima para uma comparação de valores médios entre os dois grupos é alcançada se a razão de alocação for proporcional à razão dos desvios padrão, que é de 2:1 com base nos dados anteriores. Sob as suposições acima sobre tamanhos de efeito e desvios padrão, um tamanho de amostra total de 30 (20:10) fornecerá intervalos de confiança de 95% com meia largura de aproximadamente 0,2 em qualquer grupo. A meia largura esperada de um intervalo de confiança de 95% para a diferença média entre os grupos é de 0,28. (Um teste t de duas amostras correspondente teria um poder de 80% para detectar uma diferença média de 0,4 a um nível de significância de 5%). Para a análise do teste cutâneo, os dados preliminares sugerem que com um tamanho de amostra de 20, a meia largura dos intervalos de confiança de 95% para a dose efetiva de 50% será de aproximadamente 0,25 vezes a dose efetiva de 50%, que é considerada como precisão suficiente para este estudo piloto. Consulte o apêndice para representação gráfica

   Aspectos éticos e legais

   O estudo será realizado de acordo com os requisitos legais locais e as BPC. Será realizado de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque (1964), incluindo as revisões atuais.

   Consentimento informado do sujeito

   Antes de ser admitido no estudo, o sujeito deve ter consentido em participar após a natureza, o escopo e as possíveis consequências do estudo clínico terem sido explicados de forma compreensível para ele. O sujeito deve dar consentimento por escrito. A assinatura do investigador confirmará o consentimento do sujeito. O paciente pode retirar o consentimento, mesmo sem fazer comentários, a qualquer momento e sem consequências negativas para os seus cuidados médicos futuros.

   Reconhecimento/aprovação do estudo

   Antes do início do estudo, o protocolo do estudo será submetido ao comitê de ética da universidade médica de Viena e do hospital geral de Viena (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Viena, Áustria).

   Seguro

   Todos os participantes deste estudo serão segurados na Zürich Insurance Company (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel. +43 50 1255 1255; número do seguro: 07229622-2).

   Confidencialidade

   Os nomes de todos os sujeitos serão mantidos em segredo nos arquivos dos investigadores. Os indivíduos serão identificados ao longo da documentação e avaliação pelo número atribuído a eles durante o estudo. Os participantes serão informados de que todos os resultados do estudo serão armazenados e tratados com a maior confidencialidade.

   Documentação e uso dos resultados do estudo

   Documentação dos resultados do estudo

   Todos os resultados coletados durante o estudo serão coletados em um arquivo de dados de origem e posteriormente serão transferidos para os formulários de relato de caso (CRFs). Todas as entradas nos formulários de registro de caso serão feitas de forma legível em tinta preta ou azul. Se forem feitas correções nas entradas do formulário de registro do caso, as palavras ou números serão marcados e um único traço será traçado entre eles. O valor correto será inserido ao lado da entrada e data antigas e a correção será rubricada. Entradas incorretas não devem ser cobertas com fluido corretivo ou obliteradas ou ilegíveis de qualquer forma. Os CRFs preenchidos serão assinados pelo investigador. Os CRFs serão preenchidos imediatamente após o exame final. Os registros médicos nos quais o CRF se baseia serão mantidos por pelo menos 15 anos.

   Uso dos resultados do estudo

   Os resultados deste estudo serão publicados pelos investigadores em uma revista científica e apresentados em reuniões científicas. O manuscrito será distribuído a todos os co-investigadores antes da submissão.