Cambiamenti nelle risposte immunitarie adattative e nelle risposte delle cellule effettrici all'esposizione agli allergeni nasali: uno studio pilota

Razionale dello studio

Precedenti studi sulla dinamica delle risposte cliniche e immunologiche in vivo agli allergeni nasali si sono concentrati su particolari parametri ma non hanno affrontato la cinetica dell'interazione tra i diversi fattori (es. livelli di IgE allergene-specifici, IgE locali e produzione di mediatori, sensibilità basofila, sensibilità cutanea). I ricercatori propongono quindi uno studio randomizzato in doppio cieco controllato con placebo in cui i ricercatori sfidano i pazienti per via intranasale con estratto di allergene e quindi monitorano attentamente le risposte immunitarie sia cliniche che immunologiche per un periodo di 4 mesi. Successivamente si svolgeranno altre 4 visite prima e dopo la stagione delle betulle.

Gli investigatori esamineranno le risposte immunitarie della fase immediata e tardiva alla sfida nasale dell'estratto di polline di betulla al di fuori della stagione dei pollini. I partecipanti allo studio saranno inizialmente sottoposti a 3 giorni consecutivi di test con allergeni nasali e quindi seguiti da vicino per un periodo di 1 anno. Per valutare la risposta clinica all'esposizione agli allergeni, gli investigatori utilizzeranno il test della puntura della pelle (SPT), il punteggio totale dei sintomi nasali (TNSS), l'endoscopia nasale e il misuratore di flusso nasale inspiratorio di picco (PNIF). Per valutare le risposte immunologiche verranno prelevati campioni di sangue, prelievo della mucosa nasale e secrezioni nasali.

Progettazione dello studio

In questo studio monocentrico, randomizzato, controllato con placebo, in doppio cieco, un totale di 36 pazienti (6 per uno studio preliminare) saranno reclutati in questo studio su base volontaria e saranno randomizzati per ricevere una sfida nasale con uno dei due estratto di polline o placebo. La randomizzazione sarà stratificata in base ai livelli di IgE specifiche Bet v 1 per consentire un'equa distribuzione in entrambi i gruppi. 30 I partecipanti allo studio riceveranno una provocazione nasale al di fuori della stagione dei pollini di betulla con estratto di polline di betulla o placebo per tre giorni consecutivi e successivamente saranno seguiti regolarmente per un massimo di quattro mesi.

Inizialmente, prima dello studio su 30 pazienti, 6 soggetti allergici al polline di betulla saranno sottoposti a un breve protocollo per garantire che

1. La concentrazione di allergeni utilizzata per la provocazione nasale è sufficiente a suscitare un aumento degli anticorpi IgE
2. Che le titolazioni dello skin prick test siano adeguate

3. Che i tempi di assunzione delle secrezioni nasali per la determinazione dei mediatori siano adeguati.

   Se i risultati di questi 6 pazienti dovessero rivelare che la concentrazione di allergeni nasali, le titolazioni del test cutaneo o la tempistica delle secrezioni nasali non sono adeguate, verrà presentato un emendamento al comitato etico.

   Il protocollo abbreviato includerà 5 visite:

   • visita di screening completa
   • visita completa N1
   • visita N2 senza prelievo di sangue e senza prelievo nasale
   • visita N3 senza prelievo di sangue e senza prelievo nasale
   • visita completa N7

   Visita di selezione

   Procedura

   • Firma del modulo di consenso informato (versione 2.1. per studio iniziale con protocollo breve, versione 1.8 (aggiornata per estensione) per studio principale)
   • Assegnazione del numero di screening
   • Dati demografici
   • Storia di allergia
   • Valutazione dei criteri di inclusione ed esclusione
   • Test di gravidanza per le donne se richiedono SPT
   • Storia medica
   • Farmaci concomitanti
   • Rinoscopia anteriore
   • SPT standard con estratto commerciale di: nocciolo, frassino, erba mista, ambrosia, artemisia, D. pteronyssinus, D. farina, forfora di cane e gatto, alternaria, cladosporium, istamina e controllo negativo
   • Skin prick test titolato con estratto commerciale di polline di betulla
   • Prelievo di sangue (max 60 ml di sangue eparinizzato e siero) - Una parte del campione di sangue verrà inviata direttamente al laboratorio per l'analisi dell'attivazione dei basofili, delle IgE totali e delle IgE specifiche per gli allergeni rilevanti. Dal resto del sangue, l'RNA sarà preparato e conservato a -80°C e il siero sarà separato e conservato a -20°C
   • prelievo nasale (lavaggio nasale, prelievo di curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)

   Visita N0

   Requisiti relativi alla tempistica: la visita N0 è programmata tra 2 settimane e 4 giorni prima della visita N1. Questo è solo per i pazienti che sono stati sottoposti a screening più di 3 settimane prima della visita N1

   Procedura:

   • Prelievo di sangue
   • Prelievo di campioni nasali (lavaggio, prelievo di curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • SPT titolato
   • PNIF
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita N1

   Procedura:

   • Rivalutazione dei criteri di inclusione ed esclusione (risultati IgE allergene-specifici)
   • Randomizzazione: ai soggetti verrà assegnato un numero di trattamento
   • Prelievo di sangue al basale
   • Raccolta di campioni nasali al basale (lavaggio, campionamento della mucosa nasale e campionamento delle secrezioni nasali)
   • Punteggio TNSS di base
   • Registrazione di eventi avversi (AE).
   • Farmaci concomitanti
   • PNIF dato ai pazienti e spiegazione/dimostrazione di come funziona. Ai pazienti verrà consegnato un diario cartaceo per tenere traccia dei valori giornalieri del PNIF (da N1 a N5). Questo caseificio sarà utilizzato anche per registrare i punteggi TNSS giornalieri (N4-N5).
   • Test di gravidanza
   • In. somministrazione di estratto di polline di betulla o placebo
   • Documentazione dei sintomi subito dopo la provocazione
   • Sangue, PNIF, campionamento nasale (lavaggio nasale, campionamento della curette della mucosa e campionamento della secrezione nasale) e punteggio TNSS, 20 min, 40 min, 1 ora, 2 ore, 4 ore, 20-24 ore dopo la somministrazione dell'estratto di polline di betulla (verrà eseguito il punto temporale 20-24 ore alla visita N2).
   • Campionamento nasale, punteggio PNIF e TNSS a 10 min, 3 ore, 5 ore, 6 ore, 7 ore, 8 ore dopo la somministrazione dell'estratto di polline di betulla
   • SPT titolato
   • somministrazione di farmaci di soccorso se necessario (azelastina spray nasale, desloratadina 5 mg)

   Visita N2

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N2 è prevista il giorno dopo la visita N1

   Procedura:

   • Sangue, PNIF, campionamento nasale (lavaggio, campionamento della curette della mucosa e campionamento della secrezione nasale) e punteggio TNSS (punto temporale di 20-24 ore dopo la somministrazione dell'estratto di polline di betulla in N1).
   • Registrazione AE
   • Farmaci concomitanti
   • In. somministrazione di estratto di polline di betulla o placebo seguita da un periodo di osservazione di 2 ore
   • Documentazione dei sintomi subito dopo la provocazione
   • somministrazione di farmaci di soccorso se necessario (azelastina spray nasale, desloratadina 5 mg)
   • Nota: nei primi 6 soggetti dello studio non verranno eseguiti prelievi nasali e di sangue

   Visita N3

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N3 è prevista il giorno dopo la visita N2

   Procedura:

   • Prelievo di sangue prima della provocazione
   • Prelievo di campioni nasali prima della provocazione (lavaggio, prelievo di curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • Punteggio TNSS prima della provocazione
   • SPT titolato
   • Registrazione di eventi avversi (AE).
   • Farmaci concomitanti
   • In. somministrazione di estratto di polline di betulla o placebo
   • Documentazione dei sintomi subito dopo la provocazione
   • Sangue, PNIF, campionamento nasale (lavaggio, campionamento della curette della mucosa e campionamento della secrezione nasale) e punteggio TNSS 20 min, 40 min, 1 ora, 2 ore, 4 ore, 20-24 ore e dopo la somministrazione dell'estratto di polline di betulla (il tempo di 20-24 ore verrà eseguito a visita N4).
   • Campionamento nasale, punteggio PNIF e TNSS a 10 min, 3 ore, 5 ore, 6 ore, 7 ore, 8 ore dopo la somministrazione dell'estratto di polline di betulla
   • Somministrazione di farmaci di salvataggio se necessario (azelastina spray nasale, desloratadina 5 mg)
   • Nota: nei primi 6 soggetti dello studio non verranno eseguiti prelievi nasali e di sangue

   Visita N4

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N4 è prevista il giorno dopo la visita N3

   Procedura:

   • Punteggio di sangue, PNIF, prelievo nasale (lavaggio, prelievo di curette della mucosa e prelievo di secrezione nasale) e punteggio TNSS a 20-24 ore dalla somministrazione dell'estratto di polline di betulla.

   Visita N5

   La visita N5 è prevista 14 ±4 giorni dopo la visita N4:

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • Punteggio TNSS
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa
   • Raccolta di diario cartaceo dalla Visita N1 alla N5

   Visita N6

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N6 è prevista 14 ±4 giorni dopo la visita N5

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita N7

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N7 è prevista 14 ±4 giorni dopo la visita N6

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita N8

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N8 è prevista 14 ±4 giorni dopo la visita N7

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • punto
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita N9

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N9 è prevista 14 ±4 giorni dopo la visita N8

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita N10

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N9 è programmata 14 ±4 giorni dopo la visita N9

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita N11 - Visita finale del componente di provocazione nasale

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita N11 è prevista 28 ±4 giorni dopo la visita N10

   Procedura:

   • Sangue per parametri immunologici e prelievo nasale (lavaggio, curette mucosale e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF
   • SPT titolato
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita S1 (Estensione - Approvata dal Comitato Etico MUW l'11 febbraio 2019)

   Requisiti relativi alla tempistica: la visita S1 è programmata 4 settimane prima dell'inizio previsto della stagione delle betulle (+/- 7 giorni)

   Procedura:

   • Polline di carta e diario PNIF spiegato ai pazienti e chiesto di compilare quotidianamente durante la stagione delle betulle
   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • SPT titolato
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita S2

   Requisiti relativi alla tempistica: la visita S2 è prevista 4 settimane dopo la fine della stagione delle betulle (+/- 7 giorni)

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • Diario cartaceo da collezione
   • PNIF osservato
   • SPT titolato
   • Punteggio TNSS alla visita
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita S3

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita S3 è prevista 4 settimane dopo la visita S2 - (+/- 7 giorni)

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF osservato
   • SPT titolato
   • Punteggio TNSS alla visita
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa

   Visita S4 e fine dello studio

   Requisiti relativi alla tempistica:

   La visita S4 è prevista 1 anno dopo l'inizio dell'intero studio (1 anno dopo la visita N0) +/- 7 giorni

   Procedura:

   • Prelievo di sangue e nasale (lavaggio, curette della mucosa e prelievo di secrezioni nasali)
   • PNIF osservato
   • SPT titolato
   • Punteggio TNSS alla visita
   • Registrazione AE
   • Test di gravidanza per le donne se l'ultimo test risale a più di un mese fa
   • Fine dello studio

   Descrizioni delle procedure dello studio

   Anamnesi medica dei pazienti, dati demografici, farmaci concomitanti Ai pazienti verrà chiesta la loro anamnesi, compresi i dati demografici e i farmaci concomitanti, i loro sintomi allergici inclusa l'intensità e la durata e la loro storia medica allergica.

   Storia di allergia e punteggio TNSS

   Ai pazienti verrà chiesto il verificarsi di starnuti, rinorrea, prurito nasale, congestione nasale e qualità del sonno e di classificare ciascun sintomo ad ogni visita e di tenere un registro a casa. Useranno il seguente metodo di punteggio dei sintomi: 0 = assente; 1 = lieve - presente ma facilmente tollerato; 2 = moderato - presente, il sintomo è fastidioso ma non interferisce con le attività della vita quotidiana; 3 = grave - il sintomo è difficile da tollerare e interferisce con le attività della vita quotidiana (24). Oltre a questo ci sarà una scala analogica visiva del carico totale di malattia sul modulo.

   Rinoscopia anteriore

   La rinoscopia anteriore verrà eseguita una volta durante la visita di screening per escludere variazioni anatomiche (ad es. deviazione del setto) o alterazioni patologiche (ad es. polipi nasali). Verrà eseguito utilizzando uno speculum con il paziente seduto con la testa leggermente indietro.

   Flussometro nasale inspiratorio di picco (PNIF)

   La portabilità e la facilità del PNIF offre un'opportunità unica per ottenere misurazioni obiettive mentre i pazienti sono a casa. Recentemente è stato anche validato come strumento di studio durante il test con allergeni nasali.

   Procedura:

   Alla visita 1 i pazienti verranno istruiti su come utilizzare il dispositivo PNIF (In-check, flussometro inspiratorio) e ne riceveranno uno da portare a casa fino a N5. Il PNIF utilizza un tubo a diametro variabile tarato direttamente in litri al minuto insieme ad un anello indicatore a bassa inerzia. La posizione dell'anello dopo una manovra inspiratoria indica il flusso massimo raggiunto. Il dispositivo funziona quando un paziente inala attraverso la bocca o il naso, questo fa sì che l'aria venga aspirata attraverso il misuratore e un cursore si sposta lungo la scala per indicare la velocità di inalazione. La portata raggiunta può essere rilevata controllando la posizione del cursore rispetto alla scala graduata.

   PNIF nella condotta dello studio:

   Il PNIF verrà dato ai partecipanti allo studio da portare a casa in modo che possano mantenere un latticino giornaliero o settimanale (a seconda della fase dello studio) del loro flusso d'aria nasale. Verrà inoltre chiesto loro di portarli a tutte le visite di studio in modo da poter effettuare le misurazioni PNIF osservate.

   Test della puntura della pelle

   4.5.1 Procedura: Gli allergeni vengono inseriti nel derma dell'avambraccio pungendo delicatamente la pelle attraverso una goccia (20 ul) di una soluzione contenente allergeni con una lancetta sterile con almeno 2 cm tra ogni singolo punto di applicazione. La soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% verrà utilizzata come controllo negativo e l'istamina come controllo positivo. In soggetti precedentemente sensibilizzati, entro 15 minuti dal contatto con il rispettivo allergene si verificheranno gonfiore pruriginoso e arrossamento della pelle (pomfo e reazione riacutizzata). Dopo 20 minuti, le soluzioni allergeniche verranno rimosse e i margini dei pomfi verranno tracciati con una penna a sfera. Sulla pelle verrà incollato del nastro trasparente per trasferire il contorno del pomfo al nastro per le registrazioni. La superficie dei pomfi sarà calcolata mediante planimetria digitale. Per l'inclusione, pomfi di almeno 3 mm di diametro saranno considerati reazioni positive.

   Soluzioni di prova:

   Estratto di polline di betulla disponibile in commercio e un pannello di polline di alberi e graminacee, erbe infestanti e allergeni perenni (Allergopharma, Vienna, Austria) saranno utilizzati durante la visita di screening e saranno conservati secondo le istruzioni del produttore. Come controlli, verranno utilizzate una soluzione sterile di NaCl allo 0,9% (controllo negativo) e istamina (controllo positivo, Allergopharma, Vienna, Austria). Saranno conservati secondo le istruzioni del produttore.

   SPT nella condotta dello studio:

   Visita di screening:

   Verrà eseguito un prick test cutaneo standard con estratto commerciale di polline di betulla e un pannello di polline di alberi ed erbe, erbe infestanti e allergeni perenni (tutti Allergopharma, Vienna, Austria) utilizzati nella diagnostica di routine nella clinica allergica del reparto ORL per valutare il profilo di sensibilizzazione del paziente alla visita di screening.

   Screening e visite N0, N5 - N11, S1-S4 Verrà eseguito un prick test cutaneo titolato all'estratto di betulla con diluizioni crescenti (le diluizioni saranno aumentate di un fattore 3 fino a 1:60 000 (= 11 passaggi di diluizione) per determinare la concentrazione più bassa che suscita una risposta cutanea. I test cutanei a tutte le diluizioni saranno eseguiti in quadruplicato. La soluzione commerciale di controllo positivo (istamina) e il controllo negativo verranno eseguiti in duplicato.

   Precauzioni di sicurezza Come precauzione di sicurezza, i pazienti saranno monitorati per 30 minuti dopo il test. Tutte le indagini verranno eseguite nell'ambulatorio del reparto ORL, dove sono disponibili attrezzature di emergenza complete.

   Prelievo di sangue e misurazione dei parametri immunologici

   Verranno prelevati campioni di sangue durante la visita di screening e in tutte le visite di studio mediante puntura della vena antecubitale prima del test cutaneo. Verranno prelevati un massimo di 60 ml per visita eparinizzati (ad es. per i test di sensibilità dei basofili) o per la preparazione del siero (ad es. per la valutazione dei livelli di immunoglobuline totali e allergene-specifiche o per il test RBL). Le fiale di siero saranno processate e il siero sarà conservato a -20°C. Le IgE allergene-specifiche dei campioni di sangue della visita di screening saranno misurate mediante CAP-FEIA per valutare la classe RAST allergene-specifica dei pazienti. La misurazione delle IgE, IgG, IgA e IgM sieriche totali, libere e allergene-specifiche sarà eseguita mediante CAP-FEIA, mediante misurazione con microarray o ELISA. La misurazione verrà eseguita alla fine dello studio in tutti i campioni di siero raccolti per ridurre al minimo la variazione interdosaggio. Ad ogni visita verrà eseguita la misurazione delle risposte dei basofili all'allergene, fMLP e anti-IgE. In breve, i basofili saranno esposti a varie concentrazioni di anti-IgE, fMLP o allergeni ricombinanti per 15 minuti e quindi esaminati per l'espressione di CD 63 e CD203c mediante citometria a flusso. In alternativa, il rilascio di istamina sarà determinato mediante kit di rilascio di istamina disponibili in commercio.

   Test di gravidanza

   Nelle pazienti di sesso femminile, la gravidanza sarà esclusa con un test di gravidanza standard sulle urine. Il test verrà eseguito prima del primo skin prick test alla visita di screening e successivamente una volta al mese.

   Raccolta di campioni nasali

   La raccolta del campione nasale verrà eseguita a tutte le visite. Per ogni visita i campioni verranno raccolti utilizzando FXi/PU per nasoassorbimento (contenente una matrice assorbente sintetica (SAM)) o una curette di plastica lunga 10 cm (entrambi i dispositivi di Hunt Developments, Regno Unito)

   Nasosorbimento mediante FXi/PU (Hunt Developments, Regno Unito):

   Sotto visualizzazione, il dispositivo verrà inserito nella cavità nasale e posizionato lungo la parete laterale contro il turbinato inferiore. Il dito indice del paziente verrà utilizzato per premere sugli aspetti esterni delle cartilagini nasali alare e laterale per tenere il dispositivo in posizione. Dopo 1 minuto, i dispositivi verranno rimossi e il fluido verrà estratto mediante centrifugazione. Il supernatante sarà congelato a -70°C fino a ulteriori analisi per la presenza di livelli di Ig allergene-specifici e totali, livelli di mediatori e citochine.

   Campionamento dell'mRNA della mucosa Verrà utilizzata una curette nasale di 10 cm. Sotto visualizzazione diretta la curette verrà portata ad appoggiarsi alla porzione medio-inferiore del turbinato inferiore. La curette verrà premuta contro la superficie della mucosa spostata verso l'esterno 2-3 volte. Questo movimento verrà ripetuto 2-3 volte per garantire una buona raccolta del campione. È stato dimostrato che questa curette e questa tecnica non causano disagio significativo ai pazienti e quindi presentano il vantaggio di non richiedere anestesia locale. Dopo la raccolta, le cellule saranno lisate nel tampone Qiagen RLT e conservate a -70°C per la successiva analisi dell'mRNA.

   4.9 Provocazione intranasale

   L'estratto di polline di betulla (Allergopharma, Vienna, Austria) sarà diluito fresco in una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% e sarà somministrato utilizzando una pompa dosatrice. L'allergene verrà somministrato utilizzando una pompa dosatrice che eroga 15 μl per puff a entrambe le narici alla visita N1, N2, N3. Se il paziente soffre di sintomi nasali o oculari dopo il test, verrà fornito azelastina spray nasale o desloratadina 5 mg.

   Procedura di randomizzazione

   Alla visita N1 dello studio principale, i pazienti verranno randomizzati a uno dei due gruppi (estratto di polline di betulla o placebo). I soggetti dello studio saranno randomizzati (rapporto 2:1 per la provocazione rispetto al controllo) utilizzando il programma di randomizzazione online "randomizer" (www.meduniwien.ac.at/randomizer), gestito presso l'Institute for Medical Informatics, Statistics and Documentation at Medical Università di Graz, Graz, Austria. Il rapporto 2:1 viene scelto perché si prevede che la varianza delle misurazioni di Ig e delle quantità derivate sia maggiore nel gruppo di provocazione a causa dei livelli complessivi di Ig previsti più elevati, vedere anche le considerazioni sulla dimensione del campione più avanti in questo documento.

   La randomizzazione sarà effettuata da una persona che non è coinvolta nello studio e non ha contatti con i pazienti per garantire che lo studio sarà in doppio cieco.

   Prodotti sperimentali e farmaci in studio

   Estratto di polline di betulla:

   L'estratto di polline di betulla (Allergopharma, Vienna, Austria) verrà utilizzato per il challenge intranasale. L'estratto di polline di betulla arriverà liofilizzato e sarà sciolto in cloruro di sodio sterile allo 0,9%. Il contenuto di Bet v 1 nell'estratto sarà determinato mediante immunoblotting utilizzando sonde anticorpali specifiche per Bet v 1. Infine l'estratto sarà diluito in modo che la concentrazione finale di Bet v 1 sia di 50 μg/ml poiché questa concentrazione è stata precedentemente dimostrato di suscitare cambiamenti nei livelli di IgE specifici su sfida nasale.

   Soluzioni di controllo:

   Le soluzioni di controllo comprenderanno cloruro di sodio 0,9% come controllo negativo per il prick test cutaneo e come placebo per il challenge intranasale. L'istamina (Allergopharma, Vienna, Austria) sarà utilizzata come controllo positivo per lo skin prick test. Saranno conservati secondo le istruzioni del produttore.

   Farmaci concomitanti

   Generale:

   Tutti i farmaci aggiuntivi assunti dai soggetti all'ingresso nello studio o in qualsiasi momento durante lo studio sono considerati farmaci concomitanti e saranno documentati nel file dei dati di origine. I farmaci concomitanti devono essere ridotti al minimo durante lo studio, ma se ritenuto necessario possono essere somministrati se non interferiscono con il protocollo dello studio.

   Farmaci di salvataggio:

   Sebbene gli eventi anafilattici siano molto improbabili in questo studio, devono sempre essere considerati possibili. Pertanto sarà immediatamente disponibile un kit di emergenza completo in caso di reazioni anafilattiche a SPT o provocazione nasale. Inoltre, se il paziente soffre di sintomi nasali e oculari dopo la sfida intranasale, verranno forniti azelastina spray nasale e/o desloratadina 5 mg per migliorare i sintomi.

   Farmaci concomitanti vietati:

   I soggetti devono rimanere senza farmaci che interferiscono con le procedure dello studio per tutta la durata dello studio. I seguenti trattamenti concomitanti non sono consentiti durante questo studio:

   • Corticosteroidi sistemici o topici
   • Altri farmaci immunosoppressori
   • Antistaminici o cromoglicato disodico 3 giorni prima delle visite
   • Farmaci adrenergici sistemici o intranasali
   • Psicofarmaci
   • ACE-inibitori o beta-bloccanti

   Eventi avversi

   Un evento avverso è qualsiasi evento durante uno studio clinico, comprese malattie o incidenti intercorrenti, che compromette il benessere del soggetto; può anche assumere la forma di un valore di laboratorio anomalo. Il termine evento avverso non implica una relazione causale con il trattamento in studio.

   Tutti i soggetti che manifestano eventi avversi - considerati o meno associati all'uso del trattamento in studio - saranno monitorati fino alla scomparsa dei sintomi e fino a quando qualsiasi valore di laboratorio anomalo non sarà tornato al basale, o fino a quando non vi sarà una spiegazione soddisfacente per i cambiamenti osservati, o fino alla morte , nel qual caso verrà fornito un referto patologico completo di un patologo qualificato. Tutti i risultati devono essere riportati su una pagina "evento avverso" nel modulo di registrazione del caso.

   Tutti gli eventi avversi saranno segnalati e documentati come descritto di seguito. Gli eventi avversi sono suddivisi nelle categorie "gravi" e "non gravi". Ciò determina la procedura che deve essere utilizzata per segnalare/documentare l'evento avverso.

   Definizione di eventi avversi gravi e non gravi

   Un evento avverso grave è:

   • Qualsiasi evento fatale o pericoloso per la vita
   • Qualsiasi evento che viene disabilitato in modo permanente
   • Qualsiasi evento che richieda o prolunghi il ricovero
   • Qualsiasi evento che comporti cancro, anomalie congenite o si verifichi a seguito di sovradosaggio (applicazione di una dose superiore a quella stabilita).

   Gli eventi avversi che non rientrano in queste categorie sono definiti non gravi.

   Valutazione della gravità dell'AE

   Indipendentemente dalla classificazione di un evento avverso come grave o non grave (vedi sopra), la sua gravità deve essere valutata come lieve, moderata o grave, secondo i soli criteri medici:

   Lieve = non interferisce con le attività di routine, accettabile Moderato = interferisce con le attività di routine Grave = impossibile eseguire le attività di routine, considerato inaccettabile dal medico, richiede un trattamento, richiede l'interruzione dello studio o ha un effetto residuo.

   Va notato che un evento avverso grave non deve necessariamente essere di natura grave. Indipendentemente dalla gravità, tutti gli eventi avversi gravi devono essere segnalati come di seguito.

   Segnalazione/documentazione di eventi avversi

   Gli eventi avversi sono raccolti tramite segnalazioni spontanee.

   Segnalazione/documentazione di eventi avversi gravi

   Tutti gli eventi avversi gravi che si verificano durante questo studio, considerati o meno associati al farmaco in studio, devono essere documentati su una pagina "Eventi avversi" nel modulo di registrazione del caso.

   Deve essere preparato e raccolto un rapporto di follow-up che includa tutte le nuove informazioni ottenute sull'evento grave.

   Lo sperimentatore presenterà su richiesta copie di tutti questi rapporti al comitato etico. Ove necessario, gli investigatori informeranno le autorità.

   Segnalazione/documentazione di eventi avversi non gravi

   Questi devono essere documentati su una pagina "Evento avverso" nel modulo di registrazione del caso.

   analisi statistica

   Poiché si tratta di uno studio pilota, le analisi eseguite sono considerate esplorative e generatrici di ipotesi.

   Le caratteristiche del paziente e le variabili di esito saranno descritte calcolando il massimo, il minimo, la mediana, la media e la deviazione standard per le variabili metriche e le frequenze assolute e relative per le variabili categoriali.

   Per analizzare le traiettorie temporali dei livelli di IgE e di altre variabili di esito, saranno calcolate separatamente statistiche descrittive e intervalli di confidenza al 95% per la media per ciascun punto temporale e ciascun gruppo di trattamento. Per tenere conto dei livelli basali eterogenei tra i pazienti, i risultati osservati per ciascun paziente saranno standardizzati dai rispettivi valori basali per queste analisi. Inoltre, per ciascun punto temporale saranno calcolate le differenze medie tra i gruppi e gli intervalli di confidenza al 95%. Per l'illustrazione grafica, verranno tracciate le traiettorie individuali di ciascun paziente.

   I dati osservati nello skin prick test sono costituiti da una serie di dosi di allergene e dalle risultanti misurazioni dell'area. Sulla base dei dati preliminari di otto pazienti nello studio precedente, è stato riscontrato che un modello esponenziale del tipo Area = A*(1-exp(-λ Dose) descrive in modo appropriato la relazione dose-risposta osservata nello skin prick test. Il modello verrà adattato per ciascun punto temporale in ciascun gruppo utilizzando un algoritmo dei minimi quadrati non lineare. Da questi modelli, verranno riportati il ​​tasso di risposta λ, l'area di plateau A e la dose efficace al 50% con intervalli di confidenza al 95%.

   In caso di valori mancanti, tutte le analisi verranno eseguite in base ai casi disponibili.

   Considerazioni sulla dimensione del campione:

   Data la natura esplorativa dello studio, le considerazioni sulla dimensione del campione si basano sulla precisione delle stime dei parametri. L'obiettivo primario è l'analisi dei livelli di IgE nel tempo. I dati di uno studio precedente mostrano un aumento relativo delle IgE anti-Bet v 1 quattro settimane dopo la provocazione nasale con Bet v 1 di un fattore medio di 1,4 e una deviazione standard di circa 0,5 tra i pazienti. Con un antigene di controllo, il fattore medio era 1,04 con una deviazione standard di circa 0,25. La massima precisione statistica per un confronto dei valori medi tra i due gruppi si ottiene se il rapporto di allocazione è proporzionale al rapporto delle deviazioni standard, che è 2:1 sulla base dei dati precedenti. In base alle ipotesi di cui sopra sulle dimensioni dell'effetto e sulle deviazioni standard, una dimensione totale del campione di 30 (20:10) fornirà intervalli di confidenza del 95% con una semiampiezza di circa 0,2 in entrambi i gruppi. La semiampiezza attesa di un intervallo di confidenza al 95% per la differenza media tra i gruppi è 0,28. (Un test t corrispondente a due campioni avrebbe una potenza dell'80% per rilevare una differenza media di 0,4 a un livello di significatività del 5%). Per l'analisi dello skin prick test, i dati preliminari suggeriscono che con una dimensione del campione di 20, la semiampiezza degli intervalli di confidenza al 95% per la dose efficace al 50% sarà circa 0,25 volte la dose efficace al 50%, che è considerata come precisione sufficiente per questo studio pilota. Si veda l'appendice per la rappresentazione grafica

   Aspetti etici e legali

   Lo studio sarà condotto in conformità con i requisiti legali locali e GCP. Sarà eseguito in conformità con le linee guida della Dichiarazione di Helsinki (1964), comprese le revisioni attuali.

   Consenso informato del soggetto

   Prima di essere ammesso allo studio, il soggetto deve aver acconsentito a partecipare dopo che la natura, la portata e le possibili conseguenze dello studio clinico sono state spiegate in una forma a lui comprensibile. Il soggetto deve dare il consenso per iscritto. La firma dello sperimentatore confermerà il consenso del soggetto. Il paziente può revocare il consenso, anche senza esprimere osservazioni, in qualsiasi momento e senza conseguenze negative per le sue future cure mediche.

   Riconoscimento/approvazione dello studio

   Prima dell'inizio dello studio, il protocollo dello studio sarà presentato al comitato etico dell'università medica di Vienna e dell'ospedale generale di Vienna (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Vienna, Austria).

   Assicurazione

   Tutti i soggetti che partecipano a questo studio saranno assicurati presso la compagnia assicurativa di Zurigo (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Vienna, Tel. +43 50 1255 1255; numero di assicurazione: 07229622-2).

   Riservatezza

   I nomi di tutti i soggetti saranno tenuti segreti negli archivi degli investigatori. I soggetti saranno identificati in tutta la documentazione e la valutazione in base al numero loro assegnato durante lo studio. Ai soggetti verrà detto che tutti i risultati dello studio saranno archiviati e gestiti con la massima riservatezza.

   Documentazione e utilizzo dei risultati dello studio

   Documentazione dei risultati dello studio

   Tutti i risultati raccolti durante lo studio saranno raccolti in un file di dati di origine e saranno successivamente trasferiti ai moduli di segnalazione dei casi (CRF). Tutte le voci sui moduli di registrazione dei casi saranno redatte in modo leggibile con inchiostro nero o blu. Se vengono apportate correzioni alle voci nel modulo di registrazione del caso, le parole o le cifre saranno circondate da un unico tratto. Il valore corretto verrà inserito accanto alla vecchia voce e data e la correzione verrà siglata. Le voci errate non devono essere coperte con liquido correttore o cancellate o rese illeggibili in alcun modo. I CRF compilati saranno firmati dallo sperimentatore. I CRF saranno completati immediatamente dopo l'esame finale. Le cartelle cliniche su cui si basa il CRF saranno conservate per almeno 15 anni.

   Utilizzo dei risultati dello studio

   I risultati di questo studio saranno pubblicati dai ricercatori in una rivista scientifica e presentati in riunioni scientifiche. Il manoscritto sarà distribuito a tutti i co-ricercatori prima dell'invio.