奥地利全科医生患者的 CYP2D6 多态性

研究人群：

在过去 3 年中，由于各种医疗条件而前往手术进行常规血液采样并且在过去 3 年内开具或已经开具由 CYP2D6 酶代谢的药物（或 CYP2D6 强抑制剂的药物）的未经选择的连续患者. 仅在这些患者中，CYP2D6 多态性是使用一部分 EDTA 血液样本确定的。 没有进行进一步的基因调查或额外的血液采集。

被认为有资格参加研究的患者在被告知研究目的后必须签署知情同意书。

血液采集和标本处理：

使用装有 EDTA 管 (4 ml) 的 Vacutainer 系统进行标准化血液采样，用于红细胞和白细胞计数。 300 微升采集的血液用于进一步测定 CYP2D6 多态性。

DNA的分离：

在实践实验室中使用 Spin Micro Extraction Kit®（ViennaLab，Vienna）从 EDTA 血液中提取 DNA。 使用 Bio Photometer plus (Eppendorf) 测量 DNA 的浓度和质量。 提取的 DNA 保存在 -81°C 的超低温冷冻箱（U101-86，New Brunswick Scientific Co., Inc）中，没有任何其他添加剂。

用于测定 CYP2D6 基因拷贝数的实时 PCR：

为了确定 CYP2D6 基因的拷贝数，在实践实验室中使用 CYP2D6 RealFast™ CNV 检测 (ViennaLab) 在 ABI StepOnePlus 上进行一式三份的实时 PCR。

该测试基于荧光 5' 核酸酶测定，也称为 TaqMan® 测定。 每个反应包含基因特异性引物对，用于扩增 CYP2D6 和内源控制 (EC) 基因片段，每个片段为 141 bp。 其他成分是两个双标记的基因特异性水解探针，FAM 标记的 CYP2D6 探针和 HEX 标记的 EC 探针，它们与扩增片段的内部序列杂交。 5'-荧光报告基因和 3'-淬灭剂染料在完整探针上的接近程度阻止了报告基因发出荧光。 在 PCR 的延伸阶段，Taq DNA 聚合酶的 5' - 3' 核酸外切酶活性从杂交探针上切割 5'- 荧光报告基因。 荧光团与淬灭染料的物理分离实时产生荧光信号，该信号与累积的 PCR 产物成正比。 CYP2D6 RealFast™ CNV 检测是一种相对定量检测，可比较与 CYP2D6 CNV 校准器相关的两种核酸靶标（CYP2D6 和 EC）的量。 EC 基因用于标准化不同样品之间的荧光信号，并用作 PCR 阳性对照。

为了进一步标准化数据，将 ROX 染料添加到 2 x 探针混合物中，最终浓度为 1 微升。

ABI StepOneplus 循环仪的 RT-PCR 循环条件：初始变性：95°C 10 分钟 1 个循环；变性 95°C 15 秒 40 个循环；退火/延伸 60°C 1 分钟

通过 PGX-CYP2D StripAssay™ 确定 CYP2D6 等位基因的 PCR 和杂交：

该测定用于本研究中的样本子集，仅涵盖 3 个多态位点：1795delT (2D6*6)、1934G>A (2D6*4) 和 2637delA (2D6*3)。 测试原理和程序类似于下文所述的 PGX-CYP2D6 XL StripAssay®，但对 Palm-Cycler (Corbett Life Science) 使用不同的循环条件：PCR 前：94°C/2 分钟；热循环：94°C/15 秒- 58°C/30秒-72°C/30秒（35个循环）；最终延伸：72°C/3 分钟。

通过 PGX-CYP2D6 XL StripAssay® 确定 CYP2D6 等位基因的 PCR 和杂交：

用于测定 19 个临床相关的 CYP2D6 等位基因（*1；*2 A、*2 B-M；*3、*4A-H、K、L 或 P、*4J 或 N、*4M；*5；*6 A、 B 或 D, *6C; *7, *8; *9,; *10A 或 B, *10 C 或 D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39；*40 或 *58；*41) 首先使用生物素化引物在 Palm-Cycler（Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia）上进行 PCR 扩增。 扩增产物进一步与含有等位基因特异性寡核苷酸探针的测试条杂交，该探针固定为平行线阵列。 使用链霉亲和素-碱性磷酸酶和显色底物检测结合的生物素化序列。 该反应的评估是通过使用 StripAssay®-Evaluator（ViennaLab，Vienna）手动完成的，这是一种用于确定纯合或杂合基因型的专有 PC 程序。

Palm-Cycler (Corbett Life Science) 的循环条件：PCR 前：95°C/4 分钟；热循环：95°C/25 秒- 60°C/ 45sec.-72°C/1min （36 个周期）；最终延伸：72°C/3 分钟。

统计数据：

使用 Microsoft Excel 版本 10 和用于统计计算和图形的 R 语言和环境，版本 2.9 记录和分析数据。 标准方法用于描述数据（分类数据的频率和百分比，连续数据的平均值和标准偏差）。 为了比较单一实践中开具的 CYP2D6 特异性药物的频率与下奥地利州相应处方的总数，计算了 Spearman 等级相关系数。 通过配对 t 检验计算组间差异。 p 值 < 0.05 被认为表明具有统计学意义。

由于基因型数量较少，Hardy-Weinberg 平衡是使用 Fisher 的精确卡方检验计算的。