Polimorfismo CYP2D6 em pacientes de clínica geral na Áustria

População do estudo:

Pacientes consecutivos não selecionados do consultório que visitam o consultório para uma coleta de sangue de rotina devido a várias condições médicas e aos quais foram prescritos ou foram prescritos medicamentos metabolizados pela enzima CYP2D6 (ou medicamentos que são um forte inibidor do CYP 2D6) durante os últimos 3 anos . Somente nesses pacientes o polimorfismo CYP2D6 é determinado usando uma fração da amostra de sangue com EDTA. Não são realizadas mais investigações genéticas ou coletas de sangue adicionais.

Os pacientes considerados elegíveis para participar do estudo devem assinar um consentimento informado após serem informados sobre os objetivos do estudo.

Amostragem de sangue e processamento das amostras:

É realizada uma coleta de sangue padronizada usando um sistema Vacutainer com enchimento de um tubo de EDTA (4 ml) para a contagem de glóbulos vermelhos e brancos. 300 microlitros do sangue coletado são usados ​​para posterior determinação do polimorfismo CYP2D6.

Isolamento de DNA:

O DNA é extraído do sangue EDTA no laboratório prático usando o Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Viena). A concentração e a qualidade do DNA são medidas usando um Bio Photometer plus (Eppendorf). O ADN extraído é armazenado a -81°C num congelador de temperatura ultrabaixa (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) sem quaisquer aditivos adicionais.

PCR em tempo real para determinação do número de cópias do gene CYP2D6:

Para a determinação do número de cópias do gene CYP2D6, uma PCR em tempo real em triplicado em um ABI StepOnePlus usando o Ensaio CYP2D6 RealFast™ CNV (ViennaLab) é realizada no laboratório prático.

O teste é baseado no ensaio de 5' nuclease fluorogênica, também conhecido como ensaio TaqMan®. Cada reação contém pares de primers específicos de gene para amplificação de CYP2D6 e fragmentos de gene de controle endógeno (EC) com 141 pb cada. Outros componentes são duas sondas de hidrólise específicas de genes marcadas duplamente, a sonda CYP2D6 marcada com FAM e a sonda EC marcada com HEX, que hibridam com uma sequência interna dos fragmentos amplificados. A proximidade do repórter fluorescente 5' e do corante supressor 3' em sondas intactas evita que o repórter fique fluorescente. Durante a fase de extensão da PCR, a atividade exonuclease 5'-3' da Taq DNA polimerase cliva o repórter 5'-fluorescente da sonda hibridizada. A separação física do fluoróforo do corante extintor gera um sinal fluorescente em tempo real, que é proporcional ao produto de PCR acumulado. O ensaio CYP2D6 RealFast™ CNV é um ensaio de quantificação relativa e compara a quantidade de ambos os alvos de ácido nucleico (CYP2D6 e EC) em relação ao calibrador CYP2D6 CNV. O gene EC é usado para normalizar os sinais de fluorescência entre diferentes amostras e serve como um controle positivo de PCR.

Para normalização adicional dos dados, corante ROX para uma concentração final de 1 microlitro à 2 x Probe Mix é adicionado.

Condições de ciclagem de RT-PCR para o ciclador ABI StepOneplus: Desnaturação inicial: 95°C 10 min 1 ciclo; desnaturação 95°C 15 seg 40 ciclos; recozimento/extensão 60°C 1 min.

PCR e hibridização para determinação do alelo CYP2D6 pelo PGX-CYP2D StripAssay™:

Este ensaio é usado para um subconjunto de amostras neste estudo e abrange apenas 3 loci polimórficos: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) e 2637delA (2D6*3). O princípio e o procedimento do teste são semelhantes ao PGX-CYP2D6 XL StripAssay® conforme descrito abaixo, mas usando diferentes condições de ciclo para o Palm-Cycler (Corbett Life Science): pré-PCR: 94°C/2 min; termociclagem: 94°C/15 seg.- 58°C/ 30 seg.-72°C/30 seg (35 ciclos); extensão final: 72°C/3 min.

PCR e hibridação para determinação do alelo CYP2D6 pelo PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Para a determinação de 19 alelos CYP2D6 clinicamente relevantes (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L ou P, *4J ou N, *4M; *5; *6 A, B ou D, *6C; *7, *8; *9,; *10A ou B, *10 C ou D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 ou *58; *41) uma amplificação por PCR em um Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Austrália) usando primers biotinilados é realizada pela primeira vez. Os produtos de amplificação são ainda hibridizados com uma tira de teste contendo sondas oligonucleotídicas específicas de alelos imobilizadas como uma matriz de linhas paralelas. As sequências biotiniladas ligadas são detectadas usando estreptavidina-fosfatase alcalina e substratos coloridos. A avaliação desta reação é feita manualmente usando o StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Viena), um programa de PC proprietário para determinar o genótipo homozigoto ou heterozigoto.

Condições de ciclagem para o Palm-Cycler (Corbett Life Science): pré-PCR: 95°C/4 min; termociclagem: 95°C/25 seg.- 60°C/ 45seg.-72°C/1min (36 ciclos); extensão final: 72°C/3 min.

Estatisticas:

Os dados foram registrados e analisados ​​no Microsoft Excel Versão 10 e na Linguagem e Ambiente R para Computação Estatística e Gráficos, Versão 2.9. Métodos padrão são usados ​​para a descrição dos dados (frequências e porcentagens para dados categóricos, média e desvio padrão para dados contínuos). Para comparar as frequências de medicamentos específicos para CYP2D6 prescritos em uma única clínica com o número total das respectivas prescrições na Baixa Áustria, o coeficiente de correlação de classificação de Spearman é calculado. As diferenças entre os grupos foram calculadas pelo teste t pareado. Um valor de p < 0,05 foi considerado para indicar significância estatística.

O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi calculado por meio do teste qui-quadrado exato de Fisher devido ao pequeno número de genótipos.