Polimorfismo del CYP2D6 in pazienti di medicina generale in Austria

Popolazione studiata:

Pazienti consecutivi non selezionati dell'ambulatorio che visitano l'ambulatorio per un prelievo di sangue di routine a causa di varie condizioni mediche e a cui sono stati prescritti o sono stati prescritti farmaci metabolizzati dall'enzima CYP2D6 (o farmaci che sono un forte inibitore del CYP 2D6) negli ultimi 3 anni . Solo in questi pazienti il ​​polimorfismo del CYP2D6 viene determinato utilizzando una frazione del campione di sangue EDTA. Non vengono eseguite ulteriori indagini genetiche o prelievi di sangue aggiuntivi.

I pazienti che sono considerati idonei a partecipare allo studio devono firmare un consenso informato dopo essere stati informati sugli obiettivi dello studio.

Prelievo di sangue e trattamento dei campioni:

Viene eseguito un prelievo di sangue standardizzato utilizzando un sistema Vacutainer con riempimento di una provetta EDTA (4 ml) per la conta dei globuli rossi e bianchi. 300 microlitri del sangue raccolto vengono utilizzati per un'ulteriore determinazione del polimorfismo CYP2D6.

Isolamento del DNA:

Il DNA viene estratto dal sangue EDTA nel laboratorio dello studio utilizzando lo Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Vienna). La concentrazione e la qualità del DNA vengono misurate utilizzando un Bio Photometer plus (Eppendorf). Il DNA estratto viene conservato a -81°C in un congelatore a bassissima temperatura (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) senza ulteriori additivi.

PCR in tempo reale per la determinazione del numero di copie del gene CYP2D6:

Per la determinazione del numero di copie del gene CYP2D6, nel laboratorio dello studio viene eseguita una PCR in tempo reale in triplicato su un ABI StepOnePlus utilizzando il test CYP2D6 RealFast™ CNV (ViennaLab).

Il test si basa sul test fluorogenico della 5' nucleasi, noto anche come test TaqMan®. Ciascuna reazione contiene coppie di primer gene-specifici per l'amplificazione del CYP2D6 e frammenti del gene di controllo endogeno (EC) con 141 bp ciascuno. Ulteriori componenti sono due sonde di idrolisi gene-specifiche a doppia etichetta, la sonda CYP2D6 marcata con FAM e la sonda EC marcata con HEX, che si ibridano a una sequenza interna dei frammenti amplificati. La vicinanza del reporter 5'-fluorescente e del colorante 3'-quencher su sonde intatte impedisce al reporter di fluorescenza. Durante la fase di estensione della PCR l'attività esonucleasica 5'-3' della Taq DNA polimerasi scinde il reporter 5'-fluorescente dalla sonda ibridata. La separazione fisica del fluoroforo dal colorante quencher genera un segnale fluorescente in tempo reale, che è proporzionale al prodotto PCR accumulato. Il test CYP2D6 RealFast™ CNV è un test di quantificazione relativa e confronta la quantità di entrambi i bersagli di acido nucleico (CYP2D6 e EC) in relazione al calibratore CYP2D6 CNV. Il gene EC viene utilizzato per normalizzare i segnali di fluorescenza tra diversi campioni e funge da controllo positivo della PCR.

Per un'ulteriore normalizzazione dei dati, alla miscela di sonde 2 x viene aggiunto il colorante ROX a una concentrazione finale di 1 microlitro.

Condizioni di ciclo RT-PCR per il ciclatore ABI StepOneplus: Denaturazione iniziale: 95°C 10 min 1 ciclo; denaturazione 95°C 15 sec 40 cicli; ricottura/estensione 60°C 1 min.

PCR e ibridazione per la determinazione dell'allele CYP2D6 mediante il PGX-CYP2D StripAssay™:

Questo saggio viene utilizzato per un sottoinsieme di campioni in questo studio e copre solo 3 loci polimorfici: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) e 2637delA (2D6*3). Il principio e la procedura del test sono simili al PGX-CYP2D6 XL StripAssay® come descritto di seguito, ma utilizzano condizioni di ciclo diverse per il Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94°C/2 min; termociclaggio: 94°C/15 sec.- 58°C/30 sec.-72°C/30 sec (35 cicli); estensione finale: 72°C/3 min.

PCR e ibridazione per la determinazione dell'allele CYP2D6 mediante il PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Per la determinazione di 19 alleli CYP2D6 clinicamente rilevanti (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L o P, *4J o N, *4M; *5; *6 A, B o D, *6C; *7, *8; *9,; *10A o B, *10 C o D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 o *58; *41) viene prima eseguita un'amplificazione PCR su un Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia) utilizzando primer biotinilati. I prodotti dell'amplificazione vengono ulteriormente ibridati su una striscia reattiva contenente sonde oligonucleotidiche allele-specifiche immobilizzate come una matrice di linee parallele. Le sequenze biotinilate legate vengono rilevate utilizzando streptavidina-fosfatasi alcalina e substrati colorati. La valutazione di questa reazione viene eseguita manualmente utilizzando StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Vienna), un programma per PC proprietario per determinare il genotipo omozigote o eterozigote.

Condizioni cicliche per il Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95°C/4 min; termociclaggio: 95°C/25 sec.- 60°C/45sec.-72°C/1min (36 cicli); estensione finale: 72°C/3 min.

Statistiche:

I dati sono stati registrati e analizzati utilizzando Microsoft Excel versione 10 e R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, versione 2.9. Per la descrizione dei dati vengono utilizzati metodi standard (frequenze e percentuali per i dati categorici, media e deviazione standard per i dati continui). Per confrontare le frequenze dei farmaci specifici per CYP2D6 prescritti nella singola pratica con il numero totale delle rispettive prescrizioni nella Bassa Austria, viene calcolato il coefficiente di correlazione per ranghi di Spearman. Le differenze tra i gruppi sono state calcolate mediante t-test accoppiato. Un valore p <0,05 è stato considerato per indicare significatività statistica.

L'equilibrio di Hardy-Weinberg è stato calcolato utilizzando il test chi quadrato esatto di Fisher a causa del piccolo numero di genotipi.