オーストリアの一般診療患者における CYP2D6 多型

調査対象母集団：

さまざまな病状のために定期的な採血のために外科を訪れる診療所の選択されていない連続した患者であり、過去3年間にCYP2D6酵素によって代謝される薬物（またはCYP 2D6の強力な阻害剤である薬物）を処方または処方された患者. これらの患者でのみ、EDTA 血液サンプルの一部を使用して CYP2D6 多型が決定されます。 それ以上の遺伝子調査や追加の採血は行われません。

研究に参加する資格があると考えられる患者は、研究の目的について知らされた後、インフォームド コンセントに署名する必要があります。

採血と検体の処理:

赤血球および白血球計数用のＥＤＴＡチューブ（４ｍｌ）を充填したバキュテナーシステムを使用して、標準化された採血を行う。 収集された血液の 300 マイクロリットルは、CYP2D6 多型のさらなる決定に使用されます。

DNA の分離:

Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標）（ＶｉｅｎｎａＬａｂ、Ｖｉｅｎｎａ）を使用して、実際の実験室でＥＤＴＡ血液からＤＮＡを抽出する。 Ｂｉｏ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｐｌｕｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、ＤＮＡの濃度および品質を測定する。 抽出された DNA は、超低温ディープ フリーザー (U101-86、ニュー ブランズウィック サイエンティフィック社) に添加物を加えずに -81°C で保存されます。

CYP2D6 遺伝子のコピー数を決定するためのリアルタイム PCR:

ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子のコピー数の決定のために、ＣＹＰ２Ｄ６ ＲｅａｌＦａｓｔ（商標）ＣＮＶ Ａｓｓａｙ（ＶｉｅｎｎａＬａｂ）を使用することによるＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓでの３連のリアルタイムＰＣＲが、診療所で実施される。

この試験は、TaqMan® アッセイとしても知られる蛍光発生 5' ヌクレアーゼ アッセイに基づいています。 各反応には、CYP2D6 および内因性コントロール (EC) 遺伝子フラグメントを増幅するための遺伝子特異的プライマーペアが含まれており、それぞれ 141 bp です。 さらなる成分は、2つの二重標識された遺伝子特異的加水分解プローブ、FAM標識CYP2D6プローブおよびHEX標識ECプローブであり、増幅フラグメントの内部配列にハイブリダイズします。 5'-蛍光レポーターと 3'-クエンチャー色素が無傷のプローブに近接しているため、レポーターが蛍光を発するのを防ぎます。 PCR の伸長段階では、Taq DNA ポリメラーゼの 5'-3' エキソヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプローブから 5'-蛍光レポーターが切断されます。 フルオロフォアがクエンチャー色素から物理的に分離されると、蓄積された PCR 産物に比例する蛍光シグナルがリアルタイムで生成されます。 CYP2D6 RealFast™ CNV アッセイは、相対定量アッセイであり、CYP2D6 CNV キャリブレーターに関連して両方の核酸ターゲット (CYP2D6 および EC) の量を比較します。 EC 遺伝子は、異なるサンプル間の蛍光シグナルを正規化するために使用され、PCR ポジティブ コントロールとして機能します。

データをさらに正規化するために、最終濃度が 1 マイクロリットルになるように ROX 色素を 2 x プローブ ミックスに追加します。

ABI StepOneplus サイクラーの RT-PCR サイクル条件: 初期変性: 95°C 10 分 1 サイクル;変性 95°C 15 秒 40 サイクル。アニーリング・伸長 60℃ 1分

PGX-CYP2D StripAssay™ による CYP2D6 アレル決定のための PCR およびハイブリダイゼーション:

このアッセイは、この研究のサンプルのサブセットに使用され、3 つの多型遺伝子座のみをカバーします: 1795delT (2D6*6)、1934G>A (2D6*4)、および 2637delA (2D6*3)。 テストの原理と手順は、以下に説明する PGX-CYP2D6 XL StripAssay® と似ていますが、Palm-Cycler (Corbett Life Science) では異なるサイクリング条件を使用します。プレ PCR: 94°C/2 分。サーモサイクリング: 94°C/15 秒- 58℃/30秒～72℃/30秒(35サイクル);最終伸長: 72°C/3 分。

PGX-CYP2D6 XL StripAssay® による CYP2D6 アレル決定のための PCR およびハイブリダイゼーション:

19 の臨床的に関連する CYP2D6 対立遺伝子 (*1; *2 A、*2 B-M; *3、*4A-H、K、L または P、*4J または N、*4M; *5; *6 A、 B or D, *6C; *7, *8; *9,; *10A or B, *10 C or D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 または *58; *41) ビオチン化プライマーを使用した Palm-Cycler (Corbett Life Science、Eight Mile Plains、QLD 4113、オーストラリア) での PCR 増幅が最初に実行されます。 増幅産物は、平行線のアレイとして固定化された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むテストストリップにさらにハイブリダイズされます。 結合したビオチン化配列は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼと色素基質を使用して検出されます。 この反応の評価は、StripAssay®-Evaluator (ViennaLab、ウィーン) を使用して手作業で行います。これは、ホモ接合またはヘテロ接合の遺伝子型を決定する独自の PC プログラムです。

Palm-Cycler (Corbett Life Science) のサイクリング条件: プレ PCR: 95°C/4 分。サーモサイクリング: 95°C/25 秒- 60℃/45秒～72℃/1分 (36 サイクル);最終伸長: 72°C/3 分。

統計：

データは、Microsoft Excel バージョン 10 と R 言語および統計計算とグラフィックスの環境、バージョン 2.9 を使用して記録および分析されました。 データの記述には標準的な方法が使用されます (カテゴリ データの頻度とパーセンテージ、連続データの平均と標準偏差)。 1 回の診療で処方された CYP2D6 特異的薬物の頻度を、ニーダー オーストリアでのそれぞれの処方の総数と比較するために、Spearman の順位相関係数が計算されます。 グループ間の差は、対応のある t 検定によって計算されました。 p 値 < 0.05 は、統計的有意性を示すと見なされました。

遺伝子型の数が少ないため、Hardy-Weinberg 平衡は、Fisher's Exact Chi-Square 検定を使用して計算されました。