Polymorphisme du CYP2D6 chez les patients de médecine générale en Autriche

Population étudiée :

Patients consécutifs non sélectionnés du cabinet médical visitant le cabinet pour un prélèvement sanguin de routine en raison de diverses conditions médicales et qui se sont vu prescrire ou se sont vu prescrire des médicaments métabolisés par l'enzyme CYP2D6 (ou des médicaments étant un inhibiteur puissant du CYP 2D6) au cours des 3 dernières années . Seulement chez ces patients, le polymorphisme CYP2D6 est déterminé en utilisant une fraction de l'échantillon de sang EDTA. Aucune autre enquête génétique ou collecte de sang supplémentaire n'est effectuée.

Les patients considérés comme éligibles pour participer à l'étude doivent signer un consentement éclairé après avoir été informés des objectifs de l'étude.

Prélèvement sanguin et traitement des échantillons :

Un prélèvement sanguin standardisé à l'aide d'un système Vacutainer avec remplissage d'un tube EDTA (4 ml) pour la numération des globules rouges et blancs est réalisé. 300 microlitres du sang collecté sont utilisés pour une détermination plus poussée du polymorphisme CYP2D6.

Isolement de l'ADN :

L'ADN est extrait du sang EDTA dans le laboratoire de pratique à l'aide du Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Vienne). La concentration et la qualité de l'ADN sont mesurées à l'aide d'un Bio Photometer plus (Eppendorf). L'ADN extrait est stocké à -81°C dans un congélateur à ultra-basse température (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) sans aucun autre additif.

PCR en temps réel pour la détermination du nombre de copies du gène CYP2D6 :

Pour la détermination du nombre de copies du gène CYP2D6, une PCR en temps réel en trois exemplaires sur un ABI StepOnePlus en utilisant le CYP2D6 RealFast™ CNV Assay (ViennaLab) est effectuée dans le laboratoire du cabinet.

Le test est basé sur le test fluorogène de la 5' nucléase, également connu sous le nom de test TaqMan®. Chaque réaction contient des paires d'amorces spécifiques au gène pour l'amplification du CYP2D6 et des fragments de gène de contrôle endogène (EC) de 141 pb chacun. D'autres composants sont deux sondes d'hydrolyse spécifiques à un gène à double marquage, la sonde CYP2D6 marquée par FAM et la sonde EC marquée par HEX, qui s'hybrident à une séquence interne des fragments amplifiés. La proximité du rapporteur 5'-fluorescent et du colorant 3'-extincteur sur les sondes intactes empêche le rapporteur de devenir fluorescent. Au cours de la phase d'extension de la PCR, l'activité exonucléase 5'-3' de l'ADN polymérase Taq clive le reporter fluorescent 5' de la sonde hybridée. La séparation physique du fluorophore du colorant extincteur génère un signal fluorescent en temps réel, qui est proportionnel au produit PCR accumulé. Le test CYP2D6 RealFast™ CNV est un test de quantification relative et compare la quantité des deux cibles d'acide nucléique (CYP2D6 et EC) par rapport au calibrateur CYP2D6 CNV. Le gène EC est utilisé pour normaliser les signaux de fluorescence entre différents échantillons et sert de contrôle positif PCR.

Pour une normalisation supplémentaire des données, le colorant ROX à une concentration finale de 1 microlitre au mélange de sondes 2 x est ajouté.

Conditions de cycle RT-PCR pour le cycleur ABI StepOneplus : Dénaturation initiale : 95°C 10 min 1 cycle ; dénaturation 95°C 15 s 40 cycles ; recuit/extension 60°C 1 min.

PCR et hybridation pour la détermination de l'allèle CYP2D6 par le PGX-CYP2D StripAssay™ :

Ce test est utilisé pour un sous-ensemble d'échantillons dans cette étude et ne couvre que 3 locus polymorphes : 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) et 2637delA (2D6*3). Le principe et la procédure du test sont similaires au PGX-CYP2D6 XL StripAssay® comme décrit ci-dessous mais en utilisant des conditions de cycle différentes pour le Palm-Cycler (Corbett Life Science) : pré-PCR : 94°C/2 min ; thermocyclage : 94°C/15 sec.- 58°C/ 30 sec.-72°C/30 sec (35 cycles); extension finale : 72°C/3 min.

PCR et hybridation pour la détermination de l'allèle CYP2D6 par le PGX-CYP2D6 XL StripAssay® :

Pour la détermination de 19 allèles CYP2D6 cliniquement pertinents (*1 ; *2 A, *2 B-M ; *3, *4A-H, K, L ou P, *4J ou N, *4M ; *5 ; *6 A, B ou D, *6C ; *7, *8 ; *9, ; *10A ou B, *10 C ou D ; *11 ; *12 ; *14 ; *15 ; *17 ; *29 ; *35 ; * 39 ; *40 ou *58 ; *41) une amplification par PCR sur un Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australie) à l'aide d'amorces biotinylées est d'abord réalisée. Les produits d'amplification sont en outre hybridés à une bandelette de test contenant des sondes oligonucléotidiques spécifiques d'allèles immobilisées sous la forme d'un réseau de lignes parallèles. Les séquences biotinylées liées sont détectées à l'aide de streptavidine-phosphatase alcaline et de substrats colorés. L'évaluation de cette réaction se fait manuellement en utilisant le StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Vienna), un programme PC propriétaire pour déterminer le génotype homozygote ou hétérozygote.

Conditions de cyclage du Palm-Cycler (Corbett Life Science) : pré-PCR : 95°C/4 min ; thermocyclage : 95°C/25 sec.- 60°C/ 45sec.-72°C/1min (36 cycles); extension finale : 72°C/3 min.

Statistiques:

Les données ont été enregistrées et analysées à l'aide de Microsoft Excel version 10 et du langage et environnement R pour le calcul statistique et les graphiques, version 2.9. Des méthodes standard sont utilisées pour la description des données (fréquences et pourcentages pour les données catégorielles, moyenne et écart type pour les données continues). Pour comparer les fréquences de médicaments spécifiques au CYP2D6 prescrits dans le cabinet avec le nombre total de prescriptions respectives en Basse-Autriche, le coefficient de corrélation de rang de Spearman est calculé. Les différences entre les groupes ont été calculées par test t apparié. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme indiquant une signification statistique.

L'équilibre de Hardy-Weinberg a été calculé à l'aide du test du chi carré exact de Fisher en raison du petit nombre de génotypes.