Polimorfizm CYP2D6 u pacjentów z ogólnej praktyki w Austrii

Badana populacja:

Niewyselekcjonowani kolejni pacjenci gabinetu zgłaszający się do gabinetu w celu rutynowego pobrania krwi z powodu różnych schorzeń, którym przepisano lub przepisano leki metabolizowane przez enzym CYP2D6 (lub leki będące silnym inhibitorem CYP 2D6) w ciągu ostatnich 3 lat . Tylko u tych pacjentów polimorfizm CYP2D6 jest określany przy użyciu frakcji próbki krwi zawierającej EDTA. Nie przeprowadza się dalszych badań genetycznych ani dodatkowych pobrań krwi.

Pacjenci uznani za kwalifikujących się do udziału w badaniu muszą podpisać świadomą zgodę po poinformowaniu ich o celach badania.

Pobieranie krwi i przetwarzanie próbek:

Wykonuje się wystandaryzowane pobieranie krwi za pomocą systemu Vacutainer z napełnieniem probówki EDTA (4 ml) do morfologii krwinek czerwonych i białych. 300 mikrolitrów pobranej krwi wykorzystuje się do dalszego oznaczenia polimorfizmu CYP2D6.

Izolacja DNA:

DNA jest ekstrahowane z krwi EDTA w laboratorium przy użyciu zestawu Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Wiedeń). Stężenie i jakość DNA mierzy się za pomocą Bio Photometer plus (Eppendorf). Wyekstrahowany DNA przechowuje się w temperaturze -81°C w głębokiej zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) bez żadnych dalszych dodatków.

PCR w czasie rzeczywistym w celu określenia liczby kopii genu CYP2D6:

W celu określenia liczby kopii genu CYP2D6 w laboratorium przeprowadza się reakcję PCR w czasie rzeczywistym w trzech powtórzeniach na aparacie ABI StepOnePlus przy użyciu testu CYP2D6 RealFast™ CNV (ViennaLab).

Test opiera się na teście fluorogennej 5'-nukleazy, znanym również jako test TaqMan®. Każda reakcja zawiera pary starterów specyficznych dla genu do amplifikacji fragmentów genu CYP2D6 i kontroli endogennej (EC), z których każdy ma 141 bp. Dalszymi składnikami są dwie podwójnie znakowane, specyficzne dla genu sondy do hydrolizy, sonda CYP2D6 znakowana FAM i sonda EC znakowana HEX, które hybrydyzują z wewnętrzną sekwencją zamplifikowanych fragmentów. Bliskość 5'-fluorescencyjnego barwnika reporterowego i 3'-wygaszacza na nienaruszonych sondach zapobiega fluorescencji reportera. Podczas fazy wydłużania PCR aktywność egzonukleazy 5' - 3' polimerazy DNA Taq odszczepia reporter fluorescencyjny 5' od zhybrydyzowanej sondy. Fizyczne oddzielenie fluoroforu od barwnika wygaszającego generuje sygnał fluorescencyjny w czasie rzeczywistym, który jest proporcjonalny do nagromadzonego produktu PCR. Test CYP2D6 RealFast™ CNV jest względnym testem ilościowym i porównuje ilość obu docelowych kwasów nukleinowych (CYP2D6 i EC) w odniesieniu do kalibratora CYP2D6 CNV. Gen EC jest używany do normalizacji sygnałów fluorescencji między różnymi próbkami i służy jako kontrola pozytywna PCR.

W celu dodatkowej normalizacji danych do mieszaniny 2 x Probe Mix dodaje się barwnik ROX do końcowego stężenia 1 mikrolitra.

Warunki cyklu RT-PCR dla cyklera ABI StepOneplus: Początkowa denaturacja: 95°C 10 min 1 cykl; denaturacja 95°C 15 sek. 40 cykli; wyżarzanie/wydłużanie 60°C 1 min.

PCR i hybrydyzacja w celu określenia alleli CYP2D6 za pomocą PGX-CYP2D StripAssay™:

Ten test jest stosowany dla podzbioru próbek w tym badaniu i obejmuje tylko 3 loci polimorficzne: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) i 2637delA (2D6*3). Zasada i procedura testu są podobne do PGX-CYP2D6 XL StripAssay®, jak opisano poniżej, ale przy użyciu innych warunków cyklu dla Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94°C/2 min; termocykling: 94°C/15 sek.- 58°C/30 sek.-72°C/30 sek. (35 cykli); końcowe wydłużanie: 72°C/3 min.

PCR i hybrydyzacja do oznaczania alleli CYP2D6 za pomocą PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Do określenia 19 istotnych klinicznie alleli CYP2D6 (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L lub P, *4J lub N, *4M; *5; *6 A, B lub D, *6C; *7, *8; *9,; *10A lub B, *10 C lub D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 lub *58; *41) najpierw przeprowadza się amplifikację PCR na urządzeniu Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia) przy użyciu biotynylowanych starterów. Produkty amplifikacji są dalej hybrydyzowane z paskiem testowym zawierającym sondy oligonukleotydowe swoiste dla alleli unieruchomione jako szereg równoległych linii. Związane biotynylowane sekwencje wykrywa się stosując streptawidyno-alkaliczną fosfatazę i kolorowe substraty. Ocenę tej reakcji przeprowadza się ręcznie za pomocą StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Wiedeń), zastrzeżonego programu komputerowego do określania genotypu homozygotycznego lub heterozygotycznego.

Warunki cyklu dla Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95°C/4 min; termocykl: 95°C/25 sek.- 60°C/45sek.-72°C/1min (36 cykli); końcowe wydłużanie: 72°C/3 min.

Statystyka:

Dane rejestrowano i analizowano przy użyciu programu Microsoft Excel w wersji 10 oraz języka R i środowiska do obliczeń statystycznych i grafiki, wersja 2.9. Do opisu danych stosowane są metody standardowe (częstości i procenty dla danych kategorycznych, średnia i odchylenie standardowe dla danych ciągłych). Aby porównać częstość przepisywania leków specyficznych dla CYP2D6 w pojedynczej praktyce z całkowitą liczbą odpowiednich recept w Dolnej Austrii, oblicza się współczynnik korelacji rang Spearmana. Różnice między grupami obliczono za pomocą sparowanego testu t. Uznano, że wartość p < 0,05 wskazuje na istotność statystyczną.

Równowagę Hardy'ego-Weinberga obliczono za pomocą testu Fischer's Exact Chi-Square ze względu na małą liczbę genotypów.