CYP2D6 polymorfisme hos pasienter i allmennpraksis i Østerrike

Studiepopulasjon:

Uvalgte påfølgende pasienter fra praksiskontoret som besøker operasjonen for en rutinemessig blodprøvetaking på grunn av ulike medisinske tilstander og som er foreskrevet eller har blitt foreskrevet legemidler metabolisert av CYP2D6-enzymet (eller legemidler som er en sterk hemmer av CYP 2D6) i løpet av de siste 3 årene . Bare hos disse pasientene bestemmes CYP2D6-polymorfisme ved å bruke en brøkdel av EDTA-blodprøven. Ingen ytterligere genetiske undersøkelser eller ytterligere blodinnsamlinger utføres.

Pasienter som anses å være kvalifisert til å delta i studien må signere et informert samtykke etter å ha blitt informert om formålet med studien.

Blodprøvetaking og behandling av prøvene:

Det utføres en standardisert blodprøve ved bruk av et Vacutainer-system med fylling av et EDTA-rør (4 ml) for rødt og hvitt blod. 300 mikroliter av det oppsamlede blodet brukes til videre bestemmelse av CYP2D6-polymorfismen.

Isolering av DNA:

DNA ekstraheres fra EDTA-blod i praksislaboratoriet ved å bruke Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Wien). Konsentrasjonen og kvaliteten på DNA måles ved hjelp av et Bio Photometer plus (Eppendorf). Det ekstraherte DNAet lagres ved -81°C i en dypfryser med ultralav temperatur (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc.) uten ytterligere tilsetningsstoffer.

Sanntids-PCR for bestemmelse av kopinummer av CYP2D6-genet:

For bestemmelse av kopinummeret til CYP2D6-genet utføres en sanntids-PCR i triplikater på en ABI StepOnePlus ved å bruke CYP2D6 RealFast™ CNV-analysen (ViennaLab) i praksislaboratoriet.

Testen er basert på den fluorogene 5'-nukleaseanalysen, også kjent som TaqMan®-analysen. Hver reaksjon inneholder genspesifikke primerpar for amplifikasjon av CYP2D6 og endogene kontroll (EC) genfragmenter med 141 bp hver. Ytterligere komponenter er to dobbeltmerkede, genspesifikke hydrolyseprober, den FAM-merkede CYP2D6-proben og den HEX-merkede EC-proben, som hybridiserer til en intern sekvens av de amplifiserte fragmentene. Nærheten til 5'-fluorescerende reporter og 3'-quencher-fargestoff på intakte prober hindrer reporteren i å fluorescere. Under forlengelsesfasen av PCR spalter 5'-3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq DNA-polymerase den 5'-fluorescerende reporteren fra den hybridiserte proben. Den fysiske separasjonen av fluoroforen fra quencher-fargestoffet genererer et fluorescerende signal i sanntid, som er proporsjonal med det akkumulerte PCR-produktet. CYP2D6 RealFast™ CNV-analysen er en relativ kvantifiseringsanalyse og sammenligner mengden av begge nukleinsyremålene (CYP2D6 og EC) i forhold til CYP2D6 CNV-kalibratoren. EC-genet brukes til å normalisere fluorescenssignaler mellom forskjellige prøver og fungerer som en PCR-positiv kontroll.

For ytterligere normalisering av data tilsettes ROX-fargestoff til en sluttkonsentrasjon på 1 mikroliter til 2 x Probe Mix.

RT-PCR syklusforhold for ABI StepOneplus syklus: Innledende denaturering: 95°C 10 min 1 syklus; denaturering 95°C 15 sek 40 sykluser; gløding/forlengelse 60°C 1 min.

PCR og hybridisering for CYP2D6 allelbestemmelse med PGX-CYP2D StripAssay™:

Denne analysen brukes for en undergruppe av prøver i denne studien og dekker kun 3 polymorfe loci: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) og 2637delA (2D6*3). Testprinsippet og prosedyren ligner på PGX-CYP2D6 XL StripAssay® som beskrevet nedenfor, men bruker forskjellige syklusforhold for Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94°C/2 min; termosykling: 94°C/15 sek.- 58°C/30 sek.-72°C/30 sek (35 sykluser); endelig forlengelse: 72°C/3 min.

PCR og hybridisering for CYP2D6 allelbestemmelse med PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

For bestemmelse av 19 klinisk relevante CYP2D6-alleler (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L eller P, *4J eller N, *4M; *5; *6 A, B eller D, *6C; *7, *8; *9,; *10A eller B, *10 C eller D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 eller *58; *41) en PCR-amplifikasjon på en Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia) ved bruk av biotinylerte primere utføres først. Amplifikasjonsproduktene hybridiseres videre til en teststrimmel som inneholder allelspesifikke oligonukleotidprober immobilisert som en rekke parallelle linjer. Bundet biotinylerte sekvenser påvises ved bruk av streptavidin-alkalisk fosfatase og fargesubstrater. Evalueringen av denne reaksjonen gjøres manuelt ved å bruke StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Wien), et proprietært PC-program for å bestemme den homozygote eller heterozygote genotypen.

Sykkelforhold for Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95°C/4 min; termosykling: 95°C/25 sek.- 60°C/45 sek.-72°C/1 min (36 sykluser); endelig forlengelse: 72°C/3 min.

Statistikk:

Dataene ble registrert og analysert ved hjelp av Microsoft Excel versjon 10 og R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, versjon 2.9. Standardmetoder brukes for beskrivelse av data (frekvenser og prosenter for kategoriske data, gjennomsnitt og standardavvik for kontinuerlige data). For å sammenligne frekvenser av CYP2D6-spesifikke legemidler foreskrevet i enkeltpraksisen med det totale antallet av de respektive reseptene i Niederösterreich, beregnes Spearmans rangkorrelasjonskoeffisient. Forskjeller mellom grupper ble beregnet ved paret t-test. En p-verdi < 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.

Hardy-Weinberg-likevekten ble beregnet ved å bruke Fishers Exact Chi-Square-test på grunn av det lille antallet genotyper.