Полиморфизм CYP2D6 у пациентов общей практики в Австрии

Исследуемая популяция:

Неотобранные последовательные пациенты кабинета практики, посещающие хирургию для рутинного забора крови в связи с различными заболеваниями, которым назначены или назначались препараты, метаболизирующиеся ферментом CYP2D6 (или препараты, являющиеся сильными ингибиторами CYP 2D6) в течение последних 3 лет. . Только у этих больных полиморфизм CYP2D6 определяется с помощью фракции ЭДТА-образца крови. Никаких дальнейших генетических исследований или дополнительных заборов крови не проводится.

Пациенты, которые считаются подходящими для участия в исследовании, должны подписать информированное согласие после того, как будут проинформированы о целях исследования.

Забор крови и обработка образцов:

Проводят стандартизированный забор крови с помощью системы Vacutainer с наполнением пробирки с ЭДТА (4 мл) для анализа красной и белой крови. 300 мкл собранной крови используют для дальнейшего определения полиморфизма CYP2D6.

Выделение ДНК:

ДНК экстрагируют из крови с ЭДТА в практической лаборатории с использованием набора Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Вена). Концентрацию и качество ДНК измеряют с помощью Bio Photometer plus (Eppendorf). Экстрагированную ДНК хранят при -81°C в морозильной камере сверхнизкой температуры (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) без каких-либо дополнительных добавок.

ПЦР в реальном времени для определения количества копий гена CYP2D6:

Для определения числа копий гена CYP2D6 в практической лаборатории проводится ПЦР в реальном времени в трех повторностях на ABI StepOnePlus с использованием анализа CYP2D6 RealFast™ CNV Assay (ViennaLab).

Тест основан на анализе флуорогенной 5'-нуклеазы, также известном как анализ TaqMan®. Каждая реакция содержит пары геноспецифических праймеров для амплификации CYP2D6 и эндогенного контроля (ЭК) фрагментов гена по 141 п.н. каждый. Другими компонентами являются два геноспецифических гидролизных зонда с двойной меткой, CYP2D6-зонд, меченный FAM, и зонд EC, меченный HEX, которые гибридизуются с внутренней последовательностью амплифицированных фрагментов. Близость 5'-флуоресцентного репортера и 3'-гасителя красителя на интактных зондах предотвращает флуоресценцию репортера. Во время фазы удлинения ПЦР 5'-3'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq отщепляет 5'-флуоресцентный репортер от гибридизованного зонда. Физическое отделение флуорофора от красителя-гасителя генерирует флуоресцентный сигнал в реальном времени, который пропорционален накопленному продукту ПЦР. Анализ CYP2D6 RealFast™ CNV представляет собой относительный количественный анализ и сравнивает количество обеих нуклеиновых кислот-мишеней (CYP2D6 и EC) по отношению к калибратору CYP2D6 CNV. Ген EC используется для нормализации сигналов флуоресценции между различными образцами и служит положительным контролем ПЦР.

Для дополнительной нормализации данных краситель ROX до конечной концентрации 1 мкл к 2 x Probe Mix добавляют.

Условия циклирования RT-PCR для циклера ABI StepOneplus: начальная денатурация: 95°C 10 мин 1 цикл; денатурация 95°С 15 сек 40 циклов; отжиг/удлинение 60°C 1 мин.

ПЦР и гибридизация для определения аллеля CYP2D6 с помощью теста PGX-CYP2D StripAssay™:

Этот анализ используется для подмножества образцов в этом исследовании и охватывает только 3 полиморфных локуса: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) и 2637delA (2D6*3). Принцип и процедура теста аналогичны тесту StripAssay® PGX-CYP2D6 XL, как описано ниже, но с использованием других условий циклирования для Palm-Cycler (Corbett Life Science): предварительная ПЦР: 94°C/2 мин; термоциклирование: 94°C/15 сек.- 58°C/30 сек.-72°C/30 сек. (35 циклов); конечное удлинение: 72°C/3 мин.

ПЦР и гибридизация для определения аллеля CYP2D6 с помощью теста PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Для определения 19 клинически значимых аллелей CYP2D6 (*1; *2A, *2B-M; *3, *4A-H, K, L или P, *4J или N, *4M; *5; *6A, B или D, *6C; *7, *8; *9,; *10A или B, *10 C или D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 или *58; *41) сначала проводят ПЦР-амплификацию на Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia) с использованием биотинилированных праймеров. Продукты амплификации далее гибридизуют с тест-полоской, содержащей аллель-специфические олигонуклеотидные зонды, иммобилизованные в виде массива параллельных линий. Связанные биотинилированные последовательности выявляют с помощью стрептавидин-щелочной фосфатазы и цветных субстратов. Оценка этой реакции выполняется вручную с помощью StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Вена), запатентованной программы для ПК для определения гомозиготного или гетерозиготного генотипа.

Условия цикла для Palm-Cycler (Corbett Life Science): пре-ПЦР: 95°C/4 мин; термоциклирование: 95°C/25 сек.- 60°C/45сек.-72°C/1мин. (36 циклов); конечное удлинение: 72°C/3 мин.

Статистика:

Данные были записаны и проанализированы с использованием Microsoft Excel версии 10 и R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, Version 2.9. Стандартные методы используются для описания данных (частоты и проценты для категорийных данных, среднее значение и стандартное отклонение для непрерывных данных). Для сравнения частоты назначений препаратов, специфичных для CYP2D6, в единичной практике с общим количеством соответствующих назначений в Нижней Австрии был рассчитан ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Различия между группами рассчитывали с помощью парного t-критерия. Значение p <0,05 считалось показателем статистической значимости.

Равновесие Харди-Вайнберга рассчитывали с использованием точного критерия хи-квадрат Фишера из-за небольшого числа генотипов.