Polimorfismo CYP2D6 en pacientes de medicina general en Austria

Población de estudio:

Pacientes consecutivos no seleccionados de la oficina de práctica que visitan la cirugía para una muestra de sangre de rutina debido a diversas condiciones médicas y a quienes se les recetaron o se les recetaron medicamentos metabolizados por la enzima CYP2D6 (o medicamentos que son un inhibidor fuerte de CYP 2D6) durante los últimos 3 años . Solo en estos pacientes se determina el polimorfismo CYP2D6 utilizando una fracción de la muestra de sangre con EDTA. No se realizan más investigaciones genéticas ni extracciones de sangre adicionales.

Los pacientes que se consideren elegibles para participar en el estudio deben firmar un consentimiento informado después de ser informados sobre los objetivos del estudio.

Toma de muestras de sangre y procesamiento de las muestras:

Se realiza un muestreo de sangre estandarizado utilizando un sistema Vacutainer con llenado de un tubo de EDTA (4 ml) para el conteo de glóbulos rojos y blancos. Se utilizan 300 microlitros de la sangre recolectada para la determinación adicional del polimorfismo CYP2D6.

Aislamiento de ADN:

El ADN se extrae de la sangre con EDTA en el laboratorio de práctica utilizando el Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Viena). La concentración y la calidad del ADN se miden utilizando un Bio Photometer plus (Eppendorf). El ADN extraído se almacena a -81 °C en un congelador profundo de temperatura ultrabaja (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) sin aditivos adicionales.

PCR en tiempo real para la determinación del número de copias del gen CYP2D6:

Para la determinación del número de copias del gen CYP2D6, se realiza una PCR en tiempo real por triplicado en un ABI StepOnePlus usando el ensayo CYP2D6 RealFast™ CNV (ViennaLab) en el laboratorio de práctica.

La prueba se basa en el ensayo de nucleasa 5' fluorogénica, también conocido como ensayo TaqMan®. Cada reacción contiene pares de cebadores específicos de genes para la amplificación de CYP2D6 y fragmentos de genes de control endógeno (EC) con 141 pb cada uno. Otros componentes son dos sondas de hidrólisis específicas del gen, marcadas dualmente, la sonda CYP2D6 marcada con FAM y la sonda EC marcada con HEX, que se hibridan con una secuencia interna de los fragmentos amplificados. La proximidad del indicador fluorescente 5' y el colorante extintor 3' en las sondas intactas evita que el indicador emita fluorescencia. Durante la fase de extensión de la PCR, la actividad exonucleasa 5' - 3' de la ADN polimerasa Taq escinde el indicador fluorescente 5' de la sonda hibridada. La separación física del fluoróforo del colorante extintor genera una señal fluorescente en tiempo real, que es proporcional al producto de PCR acumulado. El ensayo CYP2D6 RealFast™ CNV es un ensayo de cuantificación relativa y compara la cantidad de ambos objetivos de ácido nucleico (CYP2D6 y EC) en relación con el calibrador CYP2D6 CNV. El gen EC se utiliza para normalizar las señales de fluorescencia entre diferentes muestras y sirve como control positivo de PCR.

Para una normalización adicional de los datos, se agrega colorante ROX a una concentración final de 1 microlitro a la mezcla de sonda 2x.

Condiciones de ciclado de RT-PCR para el ciclador ABI StepOneplus: Desnaturalización inicial: 95°C 10 min 1 ciclo; desnaturalización 95°C 15 seg 40 ciclos; recocido/extensión 60°C 1 min.

PCR e hibridación para la determinación del alelo CYP2D6 mediante el PGX-CYP2D StripAssay™:

Este ensayo se usa para un subconjunto de muestras en este estudio y cubre solo 3 loci polimórficos: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) y 2637delA (2D6*3). El principio y el procedimiento de la prueba son similares a los del PGX-CYP2D6 XL StripAssay®, como se describe a continuación, pero utilizan diferentes condiciones de ciclo para el Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94 °C/2 min; termociclado: 94°C/15 seg.- 58°C/ 30 seg.-72°C/30 seg (35 ciclos); extensión final: 72°C/3 min.

PCR e hibridación para la determinación del alelo CYP2D6 mediante el PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Para la determinación de 19 alelos CYP2D6 clínicamente relevantes (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L o P, *4J o N, *4M; *5; *6 A, B o D, *6C; *7, *8; *9; *10A o B, *10 C o D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 o *58; *41) se realiza primero una amplificación por PCR en un Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia) utilizando cebadores biotinilados. Los productos de amplificación se hibridan aún más con una tira de prueba que contiene sondas de oligonucleótidos específicas de alelo inmovilizadas como una matriz de líneas paralelas. Las secuencias biotiniladas unidas se detectan usando estreptavidina-fosfatasa alcalina y sustratos de color. La evaluación de esta reacción se realiza manualmente utilizando el StripAssay®-Evaluator (ViennaLab,Vienna), un programa de PC propietario para determinar el genotipo homocigoto o heterocigoto.

Condiciones de ciclo para Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95 °C/4 min; termociclado: 95°C/25 seg.- 60°C/ 45seg.-72°C/1min (36 ciclos); extensión final: 72°C/3 min.

Estadísticas:

Los datos se registraron y analizaron utilizando Microsoft Excel Versión 10 y R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, Versión 2.9. Se utilizan métodos estándar para la descripción de datos (frecuencias y porcentajes para datos categóricos, media y desviación estándar para datos continuos). Para comparar las frecuencias de los fármacos específicos de CYP2D6 prescritos en la práctica única con el número total de prescripciones respectivas en Baja Austria, se calcula el coeficiente de correlación de rango de Spearman. Las diferencias entre los grupos se calcularon mediante la prueba t pareada. Se consideró que un valor de p < 0,05 indicaba significación estadística.

El equilibrio de Hardy-Weinberg se calculó mediante la prueba de chi-cuadrado exacto de Fisher debido al pequeño número de genotipos.