Polymorfismus CYP2D6 u pacientů praktického lékaře v Rakousku

Studijní populace:

Nevybraní po sobě jdoucí pacienti ordinace navštěvující ordinaci za účelem rutinního odběru krve z důvodu různých zdravotních stavů a ​​kterým jsou předepsány nebo jim byly předepsány léky metabolizované enzymem CYP2D6 (nebo léky, které jsou silným inhibitorem CYP 2D6) během posledních 3 let . Pouze u těchto pacientů je polymorfismus CYP2D6 stanoven pomocí frakce vzorku krve EDTA. Žádná další genetická vyšetření ani další odběry krve se neprovádějí.

Pacienti, kteří jsou považováni za způsobilé k účasti ve studii, musí poté, co byli informováni o cílech studie, podepsat informovaný souhlas.

Odběr krve a zpracování vzorků:

Provádí se standardizovaný odběr krve pomocí systému Vacutainer s plněním zkumavky s EDTA (4 ml) pro stanovení červeného a bílého krevního obrazu. 300 mikrolitrů odebrané krve se použije pro další stanovení polymorfismu CYP2D6.

Izolace DNA:

DNA je extrahována z EDTA krve v praktické laboratoři pomocí Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Vídeň). Koncentrace a kvalita DNA se měří pomocí Bio Photometer plus (Eppendorf). Extrahovaná DNA je uložena při -81 °C v ultra-nízkoteplotní hluboké mrazničce (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) bez jakýchkoli dalších přísad.

PCR v reálném čase pro stanovení počtu kopií genu CYP2D6:

Pro stanovení počtu kopií genu CYP2D6 se v praktické laboratoři provádí real-time PCR v triplikátech na ABI StepOnePlus pomocí CYP2D6 RealFast™ CNV Assay (ViennaLab).

Test je založen na fluorogenní 5' nukleázové zkoušce, známé také jako TaqMan® zkouška. Každá reakce obsahuje genově specifické páry primerů pro amplifikaci CYP2D6 a endogenní kontrolní (EC) genové fragmenty, každý o velikosti 141 bp. Dalšími složkami jsou dvě duálně značené, genově specifické hydrolyzační sondy, sonda CYP2D6 značená FAM a sonda EC značená HEX, které hybridizují s vnitřní sekvencí amplifikovaných fragmentů. Blízkost 5'-fluorescenčního reportéru a 3'-zhášecího barviva na intaktních sondách brání reportéru ve fluorescenci. Během extenzní fáze PCR 5' - 3' exonukleázová aktivita Taq DNA polymerázy štěpí 5'-fluorescenční reportér z hybridizované sondy. Fyzikální separace fluoroforu od zhášecího barviva generuje fluorescenční signál v reálném čase, který je úměrný akumulovanému produktu PCR. CYP2D6 RealFast™ CNV Assay je relativní kvantifikační test a porovnává množství obou cílových nukleových kyselin (CYP2D6 a EC) ve vztahu ke kalibrátoru CYP2D6 CNV. EC gen se používá k normalizaci fluorescenčních signálů mezi různými vzorky a slouží jako PCR pozitivní kontrola.

Pro další normalizaci dat se přidá barvivo ROX na konečnou koncentraci 1 mikrolitr k 2 x Probe Mix.

Podmínky cyklování RT-PCR pro cyklér ABI StepOneplus: Počáteční denaturace: 95 °C 10 min 1 cyklus; denaturace 95 °C 15 s 40 cyklů; žíhání / prodloužení 60°C 1 min.

PCR a hybridizace pro stanovení alely CYP2D6 pomocí PGX-CYP2D StripAssay™:

Tento test se používá pro podskupinu vzorků v této studii a pokrývá pouze 3 polymorfní lokusy: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) a 2637delA (2D6*3). Princip testu a postup jsou podobné jako u PGX-CYP2D6 XL StripAssay®, jak je popsáno níže, ale používají různé podmínky cyklování pro Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94 °C/2 min; termocyklace: 94°C/15 sec.- 58 °C/30 s-72 °C/30 s (35 cyklů); konečné prodloužení: 72°C/3 min.

PCR a hybridizace pro stanovení alely CYP2D6 pomocí PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Pro stanovení 19 klinicky relevantních alel CYP2D6 (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L nebo P, *4J nebo N, *4M; *5; *6 A, B nebo D, *6C; *7, *8; *9,; *10A nebo B, *10C nebo D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 nebo *58; *41) je nejprve provedena PCR amplifikace na Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Austrálie) s použitím biotinylovaných primerů. Produkty amplifikace se dále hybridizují s testovacím proužkem obsahujícím alelově specifické oligonukleotidové sondy imobilizované jako pole paralelních linií. Navázané biotinylované sekvence jsou detekovány pomocí streptavidin-alkalické fosfatázy a barevných substrátů. Vyhodnocení této reakce se provádí ručně pomocí StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Vienna), proprietárního PC programu pro určení homozygotního nebo heterozygotního genotypu.

Podmínky cyklování pro Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95 °C/4 min; termocyklace: 95°C/25 sec.- 60°C/ 45s-72°C/1min (36 cyklů); konečné prodloužení: 72°C/3 min.

Statistika:

Data byla zaznamenána a analyzována pomocí Microsoft Excel verze 10 a R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, verze 2.9. Pro popis dat se používají standardní metody (četnosti a procenta pro kategorická data, průměr a směrodatná odchylka pro spojitá data). Pro porovnání četnosti léků specifických pro CYP2D6 předepisovaných v jedné praxi s celkovým počtem příslušných receptů v Dolním Rakousku se vypočítává Spearmanův koeficient pořadové korelace. Rozdíly mezi skupinami byly vypočteny párovým t-testem. Hodnota p < 0,05 byla považována za statistickou významnost.

Hardy-Weinbergova rovnováha byla vzhledem k malému počtu genotypů vypočtena pomocí Fisherova Exact Chi-Square testu.