CYP2D6-Polymorphismus bei Patienten der Allgemeinmedizin in Österreich

Studienpopulation:

Unselektierte konsekutive Patienten der Praxispraxis, die aufgrund verschiedener Erkrankungen die Praxis für eine routinemäßige Blutentnahme aufsuchten und denen in den letzten 3 Jahren Medikamente verschrieben wurden oder verschrieben wurden, die durch das CYP2D6-Enzym metabolisiert werden (oder Medikamente, die ein starker Inhibitor von CYP 2D6 sind). . Nur bei diesen Patienten wird der CYP2D6-Polymorphismus anhand einer Fraktion der EDTA-Blutprobe bestimmt. Es werden keine weiteren genetischen Untersuchungen oder zusätzliche Blutentnahmen durchgeführt.

Patienten, die für die Teilnahme an der Studie in Frage kommen, müssen eine Einverständniserklärung unterschreiben, nachdem sie über die Ziele der Studie informiert wurden.

Blutentnahme und Aufbereitung der Proben:

Es erfolgt eine standardisierte Blutentnahme mittels Vacutainer-System mit Befüllung eines EDTA-Röhrchens (4 ml) für das rote und weiße Blutbild. 300 Mikroliter des gesammelten Blutes werden zur weiteren Bestimmung des CYP2D6-Polymorphismus verwendet.

Isolierung von DNA:

Die DNA-Extraktion aus EDTA-Blut erfolgt im Praxislabor mit dem Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab,Wien). Die Konzentration und Qualität der DNA wird mit einem Bio Photometer plus (Eppendorf) gemessen. Die extrahierte DNA wird ohne weitere Zusätze bei -81°C in einem Ultratiefkühlschrank (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) gelagert.

Real-Time-PCR zur Bestimmung der Kopienzahl des CYP2D6-Gens:

Zur Bestimmung der Kopienzahl des CYP2D6-Gens wird im Praxislabor eine real-time PCR in dreifacher Ausführung auf einem ABI StepOnePlus unter Verwendung des CYP2D6 RealFast™ CNV Assay (ViennaLab) durchgeführt.

Der Test basiert auf dem fluorogenen 5'-Nuklease-Assay, auch bekannt als TaqMan®-Assay. Jede Reaktion enthält genspezifische Primerpaare zur Amplifikation von CYP2D6 und endogene Kontroll(EC)-Genfragmente mit jeweils 141 bp. Weitere Bestandteile sind zwei doppelt markierte, genspezifische Hydrolysesonden, die FAM-markierte CYP2D6-Sonde und die HEX-markierte EC-Sonde, die an eine interne Sequenz der amplifizierten Fragmente hybridisieren. Die Nähe des 5'-fluoreszierenden Reporters und des 3'-Quencher-Farbstoffs auf intakten Sonden verhindert, dass der Reporter fluoresziert. Während der Verlängerungsphase der PCR spaltet die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase den 5'-fluoreszierenden Reporter von der hybridisierten Sonde ab. Die physikalische Trennung des Fluorophors vom Quencher-Farbstoff erzeugt in Echtzeit ein Fluoreszenzsignal, das proportional zum angesammelten PCR-Produkt ist. Der CYP2D6 RealFast™ CNV Assay ist ein relativer Quantifizierungsassay und vergleicht die Menge beider Nukleinsäureziele (CYP2D6 und EC) im Verhältnis zum CYP2D6 CNV Calibrator. Das EC-Gen dient zur Normalisierung von Fluoreszenzsignalen zwischen verschiedenen Proben und dient als positive PCR-Kontrolle.

Zur zusätzlichen Normalisierung der Daten wird ROX-Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 1 Mikroliter zum 2 x Sonden-Mix hinzugefügt.

RT-PCR-Zyklusbedingungen für den ABI StepOneplus Cycler: Anfängliche Denaturierung: 95 °C 10 min 1 Zyklus; Denaturierung 95°C 15 Sek. 40 Zyklen; Tempern/Verlängern 60°C 1 min.

PCR und Hybridisierung für die CYP2D6-Allelbestimmung mit dem PGX-CYP2D StripAssay™:

Dieser Assay wird für eine Untergruppe von Proben in dieser Studie verwendet und deckt nur 3 polymorphe Loci ab: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) und 2637delA (2D6*3). Das Testprinzip und -verfahren ähneln dem unten beschriebenen PGX-CYP2D6 XL StripAssay®, verwenden jedoch andere Zyklusbedingungen für den Palm-Cycler (Corbett Life Science): Prä-PCR: 94 °C/2 min; Thermocycling: 94°C/15 Sek.- 58 °C/30 Sek.–72 °C/30 Sek. (35 Zyklen); Endverlängerung: 72°C/3 min.

PCR und Hybridisierung für die CYP2D6-Allelbestimmung mit dem PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Zur Bestimmung von 19 klinisch relevanten CYP2D6-Allelen (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L oder P, *4J oder N, *4M; *5; *6 A, B oder D, *6C; *7, *8; *9,; *10A oder B, *10 C oder D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 oder *58; *41) wird zunächst eine PCR-Amplifikation auf einem Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australien) unter Verwendung von biotinylierten Primern durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte werden weiter an einen Teststreifen hybridisiert, der allelspezifische Oligonukleotidsonden enthält, die als Anordnung paralleler Linien immobilisiert sind. Gebundene biotinylierte Sequenzen werden unter Verwendung von Streptavidin-alkalischer Phosphatase und Farbsubstraten nachgewiesen. Die Auswertung dieser Reaktion erfolgt manuell mit dem StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Wien), einem proprietären PC-Programm zur Bestimmung des homozygoten oder heterozygoten Genotyps.

Zyklusbedingungen für den Palm-Cycler (Corbett Life Science): Prä-PCR: 95°C/4 min; Thermocycling: 95°C/25 Sek.- 60°C/ 45 Sek.-72°C/1 Min (36 Zyklen); Endverlängerung: 72°C/3 min.

Statistiken:

Die Daten wurden mit Microsoft Excel Version 10 und R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, Version 2.9, aufgezeichnet und analysiert. Für die Beschreibung der Daten werden Standardmethoden verwendet (Häufigkeiten und Prozentsätze für kategoriale Daten, Mittelwert und Standardabweichung für kontinuierliche Daten). Um die Häufigkeiten der in der Einzelpraxis verschriebenen CYP2D6-spezifischen Medikamente mit der Gesamtzahl der jeweiligen Verordnungen in Niederösterreich zu vergleichen, wird der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman berechnet. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einen gepaarten t-Test berechnet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als Hinweis auf statistische Signifikanz angesehen.

Das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht wurde aufgrund der geringen Anzahl an Genotypen mit Fisher´s Exact Chi-Quadrat-Test berechnet.