CYP2D6 polymorfi hos patienter i almen praksis i Østrig

Undersøgelsespopulation:

Ikke-udvalgte på hinanden følgende patienter fra praksiskontoret, der besøger operationen for en rutinemæssig blodprøvetagning på grund af forskellige medicinske tilstande, og som er ordineret eller har fået ordineret lægemidler metaboliseret af CYP2D6-enzymet (eller lægemidler, der er en stærk hæmmer af CYP 2D6) i løbet af de sidste 3 år . Kun hos disse patienter bestemmes CYP2D6-polymorfi ved hjælp af en brøkdel af EDTA-blodprøven. Der udføres ikke yderligere genetiske undersøgelser eller yderligere blodopsamlinger.

Patienter, der anses for at være berettiget til at deltage i undersøgelsen, skal underskrive et informeret samtykke efter at være blevet informeret om formålet med undersøgelsen.

Blodprøvetagning og behandling af prøverne:

Der udføres en standardiseret blodprøve ved hjælp af et Vacutainer-system med fyldning af et EDTA-rør (4 ml) til det røde og hvide blodtal. 300 mikroliter af det opsamlede blod anvendes til yderligere bestemmelse af CYP2D6-polymorfien.

Isolering af DNA:

DNA ekstraheres fra EDTA-blod i praksislaboratoriet ved at bruge Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Wien). Koncentrationen og kvaliteten af ​​DNA måles ved hjælp af et Bio Photometer plus (Eppendorf). Det ekstraherede DNA opbevares ved -81°C i en dybfryser med ultralav temperatur (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc.) uden yderligere tilsætningsstoffer.

Real-time PCR til bestemmelse af kopinummer af CYP2D6 genet:

Til bestemmelse af kopinummeret af CYP2D6-genet udføres en realtids-PCR i tre eksemplarer på en ABI StepOnePlus ved hjælp af CYP2D6 RealFast™ CNV-analysen (ViennaLab) i praksislaboratoriet.

Testen er baseret på det fluorogene 5'-nuklease-assay, også kendt som TaqMan®-assay. Hver reaktion indeholder genspecifikke primerpar til amplifikation af CYP2D6 og endogene kontrol (EC) genfragmenter med 141 bp hver. Yderligere komponenter er to dobbeltmærkede, genspecifikke hydrolyseprober, den FAM-mærkede CYP2D6-probe og den HEX-mærkede EC-probe, som hybridiserer til en intern sekvens af de amplificerede fragmenter. Nærheden af ​​5'-fluorescerende reporter og 3'-quencher farvestof på intakte prober forhindrer reporteren i at fluorescere. Under forlængelsesfasen af ​​PCR spalter 5'-3' exonukleaseaktiviteten af ​​Taq DNA polymerase den 5'-fluorescerende reporter fra den hybridiserede probe. Den fysiske adskillelse af fluoroforen fra quencher-farvestoffet genererer et fluorescerende signal i realtid, som er proportional med det akkumulerede PCR-produkt. CYP2D6 RealFast™ CNV-analysen er en relativ kvantificeringsanalyse og sammenligner mængden af ​​begge nukleinsyremål (CYP2D6 og EC) i forhold til CYP2D6 CNV-kalibratoren. EC-genet bruges til at normalisere fluorescenssignaler mellem forskellige prøver og fungerer som en PCR-positiv kontrol.

For yderligere normalisering af data tilsættes ROX-farve til en slutkoncentration på 1 mikroliter til 2 x Probe Mix.

RT-PCR-cyklusbetingelser for ABI StepOneplus-cyklus: Indledende denaturering: 95°C 10 min 1 cyklus; denaturering 95°C 15 sek 40 cyklusser; udglødning/forlængelse 60°C 1 min.

PCR og hybridisering til CYP2D6 allelbestemmelse med PGX-CYP2D StripAssay™:

Dette assay bruges til en undergruppe af prøver i denne undersøgelse og dækker kun 3 polymorfe loci: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) og 2637delA (2D6*3). Testprincippet og proceduren svarer til PGX-CYP2D6 XL StripAssay® som beskrevet nedenfor, men bruger forskellige cyklusbetingelser for Palm-Cycler (Corbett Life Science): præ-PCR: 94°C/2 min; termocykling: 94°C/15 sek.- 58°C/30 sek.-72°C/30 sek (35 cyklusser); endelig forlængelse: 72°C/3 min.

PCR og hybridisering til CYP2D6 allelbestemmelse ved PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Til bestemmelse af 19 klinisk relevante CYP2D6-alleler (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L eller P, *4J eller N, *4M; *5; *6 A, B eller D, *6C; *7, *8; *9,; *10A eller B, *10 C eller D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 eller *58; *41) først udføres en PCR-amplifikation på en Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australien) under anvendelse af biotinylerede primere. Amplifikationsprodukterne hybridiseres yderligere til en teststrimmel indeholdende allelspecifikke oligonukleotidprober immobiliseret som et array af parallelle linjer. Bundne biotinylerede sekvenser påvises under anvendelse af streptavidin-alkalisk phosphatase og farvesubstrater. Evalueringen af ​​denne reaktion udføres manuelt ved at bruge StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Wien), et proprietært pc-program til at bestemme den homozygote eller heterozygote genotype.

Cykelbetingelser for Palm-Cycler (Corbett Life Science): præ-PCR: 95°C/4 min; termocykling: 95°C/25 sek.- 60°C/45 sek.-72°C/1 min (36 cyklusser); endelig forlængelse: 72°C/3 min.

Statistikker:

Dataene blev registreret og analyseret ved hjælp af Microsoft Excel Version 10 og R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, Version 2.9. Standardmetoder anvendes til beskrivelse af data (frekvenser og procenter for kategoriske data, middelværdi og standardafvigelse for kontinuerlige data). For at sammenligne frekvenser af CYP2D6-specifikke lægemidler ordineret i den enkelte praksis med det samlede antal af de respektive recepter i Nedre Østrig, beregnes Spearmans rangkorrelationskoefficient. Forskelle mellem grupperne blev beregnet ved en parret t-test. En p-værdi < 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.

Hardy-Weinberg-ligevægten blev beregnet ved hjælp af Fishers Exact Chi-Square-test på grund af det lille antal genotyper.