오스트리아 일반 진료 환자의 CYP2D6 다형성

연구 인구:

지난 3년간 CYP2D6 효소에 의해 대사되는 약물(또는 CYP 2D6의 강력한 억제제인 ​​약물)을 처방받았거나 처방받은 적이 있는 다양한 건강 상태로 인해 일상적인 채혈을 위해 수술실을 방문하는 선택되지 않은 진료실의 연속적인 환자 . 이 환자들에서만 CYP2D6 다형성이 EDTA-혈액 샘플의 일부를 사용하여 결정됩니다. 추가 유전자 조사 또는 추가 혈액 수집은 수행되지 않습니다.

연구에 참여할 자격이 있는 것으로 간주되는 환자는 연구의 목적에 대한 정보를 받은 후 정보에 입각한 동의서에 서명해야 합니다.

표본의 혈액 샘플링 및 처리:

적혈구 및 백혈구 계수를 위해 EDTA 튜브(4ml)를 채운 Vacutainer 시스템을 사용하여 표준화된 혈액 샘플링을 수행합니다. 수집된 혈액 300마이크로리터는 CYP2D6 다형성의 추가 결정에 사용됩니다.

DNA 분리:

Spin Micro Extraction Kit®(ViennaLab,Vienna)를 사용하여 실습실에서 EDTA 혈액에서 DNA를 추출합니다. DNA의 농도와 품질은 Bio Photometer plus(Eppendorf)를 사용하여 측정됩니다. 추출된 DNA는 별도의 첨가물 없이 초저온 초저온 냉동고(U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc)에 -81°C로 보관합니다.

CYP2D6 유전자의 카피 수 결정을 위한 실시간 PCR:

CYP2D6 유전자의 복제 수를 결정하기 위해 CYP2D6 RealFast™ CNV Assay(ViennaLab)를 사용하여 ABI StepOnePlus에서 실시간 PCR을 3회 실시 실험실에서 수행합니다.

테스트는 TaqMan® 분석으로도 알려진 형광 발생 5' 뉴클레아제 분석을 기반으로 합니다. 각 반응에는 CYP2D6 증폭을 위한 유전자 특이적 프라이머 쌍과 각각 141bp의 내인성 제어(EC) 유전자 단편이 포함되어 있습니다. 추가 구성 요소는 증폭된 단편의 내부 서열에 혼성화되는 2개의 이중 표지된 유전자 특이적 가수분해 프로브, FAM 표지된 CYP2D6 프로브 및 HEX 표지된 EC 프로브입니다. 손상되지 않은 프로브에 대한 5'-형광 리포터 및 3'-소광제 염료의 근접성은 리포터가 형광을 발하는 것을 방지합니다. PCR의 확장 단계 동안 Taq DNA 중합효소의 5' - 3' 엑소뉴클레아제 활성은 혼성화 프로브에서 5'-형광 리포터를 절단합니다. quencher 염료에서 fluorophore의 물리적 분리는 실시간으로 형광 신호를 생성하며 이는 축적된 PCR 제품에 비례합니다. CYP2D6 RealFast™ CNV 분석은 상대 정량 분석이며 CYP2D6 CNV Calibrator와 관련하여 두 핵산 표적(CYP2D6 및 EC)의 양을 비교합니다. EC 유전자는 다른 샘플 간의 형광 신호를 정규화하는 데 사용되며 PCR 양성 대조군 역할을 합니다.

데이터의 추가 정규화를 위해 ROX 염료를 2 x 프로브 믹스에 최종 농도 1마이크로리터로 추가합니다.

ABI StepOneplus 순환기의 RT-PCR 순환 조건: 초기 변성: 95°C 10분 1주기; 변성 95°C 15초 40주기; 어닐링/연장 60°C 1분

PGX-CYP2D StripAssay™에 의한 CYP2D6 대립유전자 결정을 위한 PCR 및 혼성화:

이 분석은 이 연구에서 샘플의 하위 집합에 사용되며 3개의 다형성 유전자좌: 1795delT(2D6*6), 1934G>A(2D6*4) 및 2637delA(2D6*3)만 포함합니다. 테스트 원리 및 절차는 아래에 설명된 PGX-CYP2D6 XL StripAssay®와 유사하지만 Palm-Cycler(Corbett Life Science)에 대해 다른 주기 조건을 사용합니다: 사전 PCR: 94°C/2분; 열순환: 94℃/15초- 58℃/30초 - 72℃/30초(35주기); 최종 신장: 72℃/3분.

PGX-CYP2D6 XL StripAssay®에 의한 CYP2D6 대립유전자 결정을 위한 PCR 및 혼성화:

19개의 임상적으로 관련된 CYP2D6 대립 유전자(*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L 또는 P, *4J 또는 N, *4M; *5; *6 A, B 또는 D, *6C, *7, *8, *9, *10A 또는 B, *10 C 또는 D, *11, *12, *14, *15, *17, *29, *35, * 39; *40 또는 *58; *41) 비오티닐화된 프라이머를 사용하여 Palm-Cycler(Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australia)에서 PCR 증폭을 먼저 수행한다. 증폭 산물은 평행선 배열로 고정된 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 테스트 스트립에 추가로 혼성화됩니다. 바운드 비오티닐화 서열은 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 및 색상 기질을 사용하여 검출됩니다. 이 반응의 평가는 동형접합 또는 이형접합 유전자형을 결정하기 위한 독점 PC 프로그램인 StripAssay®-Evaluator(ViennaLab,Vienna)를 사용하여 수동으로 수행됩니다.

Palm-Cycler(Corbett Life Science)의 순환 조건: 사전 PCR: 95°C/4분; 열 순환: 95°C/25초- 60°C/45초-72°C/1분 (36주기); 최종 신장: 72℃/3분.

통계:

데이터는 Microsoft Excel 버전 10과 통계 컴퓨팅 및 그래픽용 R 언어 및 환경 버전 2.9를 사용하여 기록 및 분석되었습니다. 데이터 설명에는 표준 방법이 사용됩니다(범주 데이터의 경우 빈도 및 백분율, 연속 데이터의 경우 평균 및 표준 편차). 단일 진료에서 처방된 CYP2D6 특정 약물의 빈도를 Lower Austria의 각 처방의 총 수와 비교하기 위해 Spearman의 순위 상관 계수가 계산됩니다. 그룹 간의 차이는 paired t-test로 계산했습니다. p-값 < 0.05는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었습니다.

Hardy-Weinberg-평형은 소수의 유전자형으로 인해 Fisher의 Exact Chi-Square 테스트를 사용하여 계산되었습니다.