CYP2D6-polymorfisme bij patiënten in de huisartsenpraktijk in Oostenrijk

Studiepopulatie:

Niet-geselecteerde opeenvolgende patiënten van het praktijkbureau die de praktijk bezoeken voor een routinematige bloedafname vanwege verschillende medische aandoeningen en die gedurende de laatste 3 jaar medicijnen hebben voorgeschreven of gekregen die worden gemetaboliseerd door het CYP2D6-enzym (of medicijnen die een sterke remmer van CYP 2D6 zijn) . Alleen bij deze patiënten wordt CYP2D6-polymorfisme bepaald met een fractie van het EDTA-bloedmonster. Er worden geen verdere genetische onderzoeken of aanvullende bloedafnames uitgevoerd.

Patiënten die geacht worden in aanmerking te komen voor deelname aan de studie, moeten een geïnformeerde toestemming ondertekenen nadat ze zijn geïnformeerd over de doelstellingen van de studie.

Bloedafname en verwerking van de monsters:

Er wordt een gestandaardiseerde bloedafname uitgevoerd met behulp van een Vacutainer-systeem met vulling van een EDTA-buisje (4 ml) voor het aantal rode en witte bloedcellen. 300 microliter van het verzamelde bloed wordt gebruikt voor verdere bepaling van het CYP2D6-polymorfisme.

Isolatie van DNA:

DNA wordt geëxtraheerd uit EDTA-bloed in het praktijklaboratorium met behulp van de Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Wenen). De concentratie en kwaliteit van DNA wordt gemeten met een Bio Photometer plus (Eppendorf). Het geëxtraheerde DNA wordt bij -81°C opgeslagen in een ultra-lage temperatuur diepvriezer (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc) zonder verdere toevoegingen.

Real-time PCR voor bepaling van het aantal kopieën van het CYP2D6-gen:

Voor de bepaling van het aantal kopieën van het CYP2D6-gen wordt in het praktijklaboratorium een ​​real-time PCR in drievoud uitgevoerd op een ABI StepOnePlus met behulp van de CYP2D6 RealFast™ CNV Assay (ViennaLab).

De test is gebaseerd op de fluorogene 5'-nuclease-assay, ook wel bekend als TaqMan®-assay. Elke reactie bevat genspecifieke primerparen voor amplificatie van CYP2D6 en endogene controle (EC) genfragmenten met elk 141 bp. Andere componenten zijn twee duaal gemerkte, genspecifieke hydrolyseprobes, de FAM-gelabelde CYP2D6-probe en de HEX-gelabelde EC-probe, die hybridiseren met een interne sequentie van de geamplificeerde fragmenten. De nabijheid van de 5'-fluorescerende reporter en 3'-quencher-kleurstof op intacte sondes voorkomt dat de reporter fluoresceert. Tijdens de verlengingsfase van PCR splitst de 5'-3'-exonuclease-activiteit van Taq DNA-polymerase de 5'-fluorescente reporter van de gehybridiseerde probe. De fysieke scheiding van de fluorofoor van de quencher-kleurstof genereert in realtime een fluorescerend signaal dat evenredig is met het geaccumuleerde PCR-product. De CYP2D6 RealFast™ CNV-assay is een relatieve kwantificeringsassay en vergelijkt de hoeveelheid van beide nucleïnezuurdoelen (CYP2D6 en EC) in relatie tot de CYP2D6 CNV-kalibrator. Het EC-gen wordt gebruikt om fluorescentiesignalen tussen verschillende monsters te normaliseren en dient als positieve PCR-controle.

Voor extra normalisatie van gegevens wordt ROX-kleurstof tot een eindconcentratie van 1 microliter aan de 2 x Probe Mix toegevoegd.

RT-PCR-cycluscondities voor de ABI StepOneplus-cycler: Initiële denaturatie: 95°C 10 min 1 cyclus; denaturatie 95°C 15 sec 40 cycli; uitgloeien/uitrekken 60°C 1 min.

PCR en hybridisatie voor CYP2D6-allelbepaling door de PGX-CYP2D StripAssay™:

Deze assay wordt gebruikt voor een subset van monsters in dit onderzoek en omvat slechts 3 polymorfe loci: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) en 2637delA (2D6*3). Het testprincipe en de procedure zijn vergelijkbaar met de PGX-CYP2D6 XL StripAssay® zoals hieronder beschreven, maar met andere cyclusomstandigheden voor de Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94°C/2 min; thermocycling: 94°C/15 sec.- 58°C/ 30 sec.-72°C/30 sec (35 cycli); uiteindelijke verlenging: 72°C/3 min.

PCR en hybridisatie voor CYP2D6-allelbepaling door de PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

Voor de bepaling van 19 klinisch relevante CYP2D6-allelen (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L of P, *4J of N, *4M; *5; *6 A, B of D, *6C; *7, *8; *9,; *10A of B, *10 C of D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 of *58; *41) eerst wordt een PCR-amplificatie uitgevoerd op een Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australië) met behulp van gebiotinyleerde primers. De amplificatieproducten worden verder gehybridiseerd met een teststrip die allelspecifieke oligonucleotideprobes bevat die zijn geïmmobiliseerd als een reeks parallelle lijnen. Gebonden gebiotinyleerde sequenties worden gedetecteerd met behulp van streptavidine-alkalische fosfatase en kleursubstraten. De evaluatie van deze reactie wordt handmatig gedaan met behulp van de StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Wenen), een eigen pc-programma om het homozygote of heterozygote genotype te bepalen.

Fietscondities voor de Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95°C/4 min; thermocycling: 95°C/25 sec.- 60°C/ 45sec.-72°C/1min (36 cycli); uiteindelijke verlenging: 72°C/3 min.

Statistieken:

De gegevens zijn vastgelegd en geanalyseerd met behulp van Microsoft Excel versie 10 en de R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, versie 2.9. Standaardmethoden worden gebruikt voor de beschrijving van gegevens (frequenties en percentages voor categorische gegevens, gemiddelde en standaarddeviatie voor continue gegevens). Om de frequenties van CYP2D6-specifieke geneesmiddelen die in de enkele praktijk worden voorgeschreven, te vergelijken met het totale aantal respectieve voorschriften in Neder-Oostenrijk, wordt de rangcorrelatiecoëfficiënt van Spearman berekend. Verschillen tussen groepen werden berekend door gepaarde t-test. Een p-waarde < 0,05 werd beschouwd als een statistische significantie.

Het Hardy-Weinberg-evenwicht werd berekend met behulp van Fisher's Exact Chi-Square-test vanwege het kleine aantal genotypen.