通过 NGS 访问埃及 COVID-19 全基因组并与国际全球数据库进行比较 (Strain)

案例选择：

100 例 COVID-19 样本在 Ain Shams 大学专科医院实验室（在大学参考实验室）被证明呈阳性，将在菌株研究中进行测试。

病毒检测：

样品采集：

鼻咽和口咽拭子将从疑似病例中取出，并放入特定的病毒转运培养基中。

一根口咽拭子 (OS) 和一根鼻咽拭子 (NS) 从住院的 SARI 患者（成人和儿童）中收集，然后一起添加到一根含有 2ml 病毒转运培养基 (VTM) 的 15ml Falcon 试管中。 拭子由训练有素的医生或医疗专业人员获得。

口咽拭子：使用带有尼龙纤维拭子涂药器的干燥无菌尖端擦拭扁桃体和咽后部。 将拭子置于标有患者唯一 ID 并含有 2ml VTM（由牛白蛋白组分 V、HEPES 缓冲液、青霉素和链霉素在 HANK 平衡盐溶液中的无菌溶液组成）的 15 ML Falcon 试管中。 然后切断涂药棒。

鼻咽拭子：将带有尼龙纤维拭子涂药器的柔性无菌尖端插入鼻孔并返回鼻咽部并在原位放置几秒钟。 然后通过旋转运动缓慢取出。 将拭子插入与咽喉拭子相同的管中，并切断轴。

示例程序：

装有鼻咽和口咽拭子的试管将使用涡旋混合器剧烈搅动 10 秒。 然后应将两个拭子从试管中取出并使用无菌镊子丢弃，这些镊子应从一个样品消毒到另一个样品以避免交叉污染。

将生成的上清液 (VTM/UTM) 倒入标有患者 ID 的 2 个低温小瓶中。

一个低温小瓶将立即储存在 -70°C 冰箱或较低温度下，例如液氮罐，用于 QA 和 COVID-19 的进一步表征。

另一个小瓶将根据实验室容量进行测试：

病毒 RNA 分离：

使用由 thermofisher 或其他推荐公司提供的市售套件。 工作将在完全无菌条件下的生物安全 2 级柜中完成。

COVID-19 检测：

使用实时逆转录聚合酶链反应 (rRT-PCR)，可以对通过各种方法获得的呼吸道样本进行测试，包括鼻咽拭子或痰液样本。 结果通常在几个小时内可用。 分子方法利用聚合酶链反应 (PCR) 以及核酸测试和其他先进的分析技术，使用实时逆转录聚合酶链反应检测病毒的遗传物质以用于诊断目的。 由 HVD、thermofisher 和其他公司提供的商用套件。

使用下一代测序 (NGS) 进行冠状病毒研究 一种调查整个冠状病毒基因组以进行流行病学调查的方法：微生物学家和病毒学家面临的主要挑战是预测病原体的进化和出现模式。 像冠状病毒这样的 RNA 病毒具有高度遗传变异的生物学特征，这使它们看起来像一团突变体。 冠状病毒变体还通过动物宿主（例如蝙蝠和蛇）内的抗原转变而出现。 Ion Torrent 靶向下一代测序 (NGS) 可简化 SARS-CoV-2（导致 COVID-19 的冠状病毒）的完整基因组测序和流行病学研究的研究工作流程。 通过将一组高度特异性的通用冠状病毒引物与高保真预混液结合使用，所有基因组片段都会被扩增，DNA 扩增子会在任何 Ion Torrent 系统上进行测序，从而在一天之内提供高度准确的冠状病毒分型。

Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel 由 2 个池组成，扩增子长度范围为 125-275 bp，用于完整的病毒基因组测序和变异检测。

NGS 数据的生物信息学分析下一代测序或 NGS 可以生成大量数据，而挑战在于找到正确分析数据的方法。 在这项研究中，我们将使用一些生物信息学工具来分析和跟踪埃及的疫情。

Genome Detective 生物信息学工具，从测序仪中获取原始数据，过滤掉非病毒的结果，拼凑基因组并使用它来识别病毒。 它不依赖于任何先前的猜测或假设，因此它甚至可以识别以前从未见过的病毒。 这被用来确认比利时的第一例 COVID-19 病例，并将其确定为与 SARS 相关的冠状病毒。

NextStrain 是一种在线资源，它使用基因组数据实时监测病毒等致病生物的进化。 它追踪了几次爆发，包括寨卡病毒、埃博拉病毒和登革热病毒，甚至被用来为世界卫生组织制定季节性流感政策提供信息。

NextStrain 已经拥有 700 多个新型冠状病毒的基因组，可用于通过检测病毒的新突变来追踪疫情。 这些突变不一定会影响病毒的行为方式，但它们可以作为一种遗传特征，将相关病例联系起来。 就像通过 DNA 测试追溯您的祖先一样，例如，在马德里测序的病毒可能具有突变，表明它起源于意大利的爆发。

对病例进行测序将变得更加重要，因为当我们开始打击（大流行）（我们希望能够实现）时，它将告诉我们仍有多少传播链在传播，以及病毒是否正在从一个地区传播到另一个地区。

这些 2019-nCoV 基因组和其他冠状病毒基因组的系统发育分析将由病毒学顾问完成

将使用 MEGA 软件（版本 7.0.14）通过 ClustalW 程序执行多序列比对。 系统发育树将通过最大似然法与 MEGA 软件（版本 7.0.14）构建。 全基因组病毒序列将保存在全球共享所有流感数据倡议的数据集中（GISAISD，No. EPI_ISL_402123，EPI_ISL_403928-31）。