L-PRF Plus 非手术牙周治疗

材料和方法 研究设计和患者选择 开展了一项分口随机对照临床试验，招募了 13 名患者（8 名男性和 5 名女性，平均年龄 52.3 ± 9.4 岁）。 患者被告知该研究的益处和风险，并且每个参与者都签署了知情同意书。

非手术牙周治疗 一名牙周病医生 (L.C.) 进行所有牙周治疗。 NSPT 包括在 48 小时内使用超声波和手持器械进行局部麻醉的两次刮治和根面平整 (SRP) 疗程。 此外，在分配给测试组的象限中与 PPD ≥ 6 mm 相关的部位用 L-PRF 渗出液冲洗，并用纵向的 L-PRF 膜片​​填充。 患者接受软食指导，用 0.12% 氯己定仔细柔和地漱口，7 天内不刷牙以避免 L-PRF 去除。 在此期间后，给予以下指导：改进的 Bass 刷牙技术、牙线和牙缝刷，以及额外 7 天的 0.12% 氯己定漱口水。 每次预约时，临床医生也会进行严格的卫生控制。

L-PRF 膜制备 两份静脉血样本收集在 2 个 10 ml 真空采血管（红杯）中，不含抗凝剂。 根据 Temmerman 等人描述的方案，使用台式离心机（IntraSpinTM, Intralock®, Florida, USA）将它们以 408 g 离心 12 分钟 18 将 L-PRF 凝块从试管中取出，与红细胞分离并置于 Xpression 盒（IntraSpinTM，Intralock®，美国佛罗里达州）中以将它们轻轻压入膜中。 将膜切成纵向碎片以填充 ≥ 6mm 的牙周袋。 在压缩过程中释放的渗出物，称为 L-PRF 渗出物，被吸入以冲洗处理过的口袋。 （图1）

临床测量所有临床测量均由一名经过培训和校准的检查员（新泽西州）进行，该检查员对分配的治疗蒙面，使用基本检查仪器套件和北卡罗来纳大学编号。 15 种颜色编码的牙周探针。 在基线和治疗后 6 周、3 个月和 6 个月时测量以下临床参数：探诊深度 (PPD)、临床附着水平 (CAL)、牙龈退缩 (GR)、探诊出血 (BOP) 和 O´ Leary 菌斑指数 (PI).19 此外，使用 100 毫米视觉模拟量表 (VAS)（0 表示无痛，50 表示平均，100 表示难以忍受的疼痛）在 24 小时、6 周、3 个月和治疗后6个月。 计算 PPD、CAL、GR、BOP、PI 和 RS 的变化（基线测量值与 1、3 和 6 个月时的差异）。

GCF 收集 GCF 样本在记录临床测量（基线、治疗后 6 周和 3 个月）之前从每个象限的最深处收集，以评估牙龈卟啉单胞菌 (P.g)、伴放线聚集杆菌 (A.a)、 Prevotella intermedia (P.i) 和 Fusobacterium nucleatum (F.n)。 用棉卷隔离样品区域，并使用适当的抽吸和空气喷雾避免唾液污染。 然后，插入牙髓 #35 纸尖，直到感觉到轻微阻力，并保持 30 秒。 将纸点立即插入 Eppendorf 管中并储存在 -80ºC 以供将来分析。

微生物处理 样品解冻后，加入 1ml 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 并匀化。 然后，将 400 μl 的每个样品以 13200 rpm 离心 3 分钟。 将获得的颗粒分散在 200 μl InstaGene 中。 根据制造商的说明，使用 InstaGene 基质（Bio-Rad Life Science Research, Hercules, CA, USA）提取 DNA。 5 微升纯化的 DNA 用于牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌、具核梭杆菌和中间普氏菌的定量。 使用 CFX96 实时系统（Biorad，Hercules，CA，USA）使用 Taqman 5' 核酸酶测定 PCR 方法检测和定量细菌 DNA，进行定量聚合酶链反应 (qPCR) 测定。 Taqman 反应包含 12.5 μl Mastermix（Eurogentec，Seraing，比利时）、4.5 μl 无菌蒸馏水、1 μl 物种特异性引物和探针（表 1）和 5 μl 模板 DNA。 所有引物/探针组的测定条件包括初始 50°C 2 分钟，然后是 95°C 10 分钟的变性步骤，然后是 95°C 15 秒和 60°C 60 秒的 45 个循环. 定量基于质粒标准曲线。 计算第 6 周、第 3 个月和第 6 个月时细菌浓度的增量（基线测量值与第 6 周、第 3 个月和第 6 个月时的差异）。

随机化、分配隐藏和校准 使用掷硬币法将患者的象限分配到两个治疗组：（SRP + L-PRF）或对照组（单独的 SRP）。

在开始研究之前，对以下参数进行了两次记录：五名患者的 PPD、GR 和 CAL，第一次和第二次记录之间有 24 小时的间隔，以验证内部检查者的准确性。 除第三磨牙外，所有牙齿均通过 6 个部位（近颊、中颊、远颊、近中舌/腭、中舌/腭和远舌/腭）的牙周探查进行测量。 如果基线和 24 小时后的测量值在 95% 的水平上在 1 毫米以内（重复测量值之间的相关系数；r = 0.95），则接受校准。

统计分析 为了在 α 水平为 0.05 和 β 水平为 0.10（功效 = 0.9）时检测 1.2 mm 的 PPD 平均差异和 1.0 的标准偏差（功效 = 0.9），需要 10 名患者的样本量。 尽管有结果，但为了预测研究期间可能退出，考虑了 n = 16 名患者的样本量。

细菌计数进行对数转换。 应用线性混合模型，变量患者作为随机因素，时间和治疗作为两个交叉固定因素。 吸烟和 PI 被视为协变量。 设置对比以计算处理之间的不同时间点和分开的每个处理相对于基线的变化。 根据 Sidak 对同时假设检验进行了校正。 创建了残差值的正态分位数图和残差点图，表明可以做出统计模型的假设。