L-PRF Plus Niechirurgiczne leczenie przyzębia

Materiały i metody Projekt badania i wybór pacjentów Przeprowadzono randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne z podziałem jamy ustnej, do którego włączono 13 pacjentów (8 mężczyzn i 5 kobiet, średni wiek 52,3 ± 9,4 lat). Pacjenci zostali poinformowani o korzyściach i zagrożeniach związanych z badaniem, a każdy uczestnik podpisał świadomą zgodę.

Niechirurgiczne leczenie periodontologiczne Wszystkie zabiegi periodontologiczne wykonywał jeden lekarz periodontolog (L.C.). NSPT składało się z dwóch sesji skalingu i wygładzania korzeni (SRP) w ciągu 48 godzin w znieczuleniu miejscowym przy użyciu narzędzi ultradźwiękowych i ręcznych. Dodatkowo miejsca związane z PPD ≥ 6 mm w kwadrancie przydzielonym grupie badanej przepłukano wysiękiem L-PRF i wypełniono podłużnymi fragmentami membrany L-PRF. Chore otrzymały zalecenia dotyczące miękkiej diety, starannego i łagodnego płukania jamy ustnej chlorheksydyną 0,12% oraz nie szczotkowania zębów przez 7 dni w celu uniknięcia usunięcia L-PRF. Po tym okresie zalecono zmodyfikowaną technikę szczotkowania Bassa, nić dentystyczną i szczoteczki międzyzębowe oraz płukankę jamy ustnej chlorheksydyną 0,12% przez dodatkowe 7 dni. Podczas każdej wizyty przeprowadzano również ścisłą kontrolę higieny przez klinicystę.

Przygotowanie membrany L-PRF Dwie próbki krwi żylnej pobrano do 2 probówek Vacutainer (czerwony kubek) o pojemności 10 ml bez antykoagulantu. Wirowano je przy 408 g przez 12 minut przy użyciu wirówki stołowej (IntraSpinTM, Intralock®, Florida, USA) zgodnie z protokołem opisanym przez Temmerman i wsp.18 Skrzepy L-PRF usunięto z probówki, oddzielono od krwinek czerwonych i umieszczono w pudełku Xpression (IntraSpinTM, Intralock®, Floryda, USA) w celu delikatnego sprasowania ich w membrany. Membrany pocięto na podłużne kawałki, aby wypełnić kieszonki przyzębne ≥ 6 mm. Uwolniony podczas ucisku wysięk zwany wysiękiem L-PRF odsysano w celu przepłukania leczonych kieszonek. (Rysunek 1)

Pomiary kliniczne Wszystkie pomiary kliniczne zostały przeprowadzone przez jednego wyszkolonego i skalibrowanego egzaminatora (N.J.), który był zamaskowany do przypisanego leczenia, przy użyciu podstawowego zestawu narzędzi do badań i urządzenia University of North Carolina nr. 15 kodowanych kolorami sond periodontologicznych. Następujące parametry kliniczne mierzono na początku leczenia oraz po 6 tygodniach, 3 miesiącach i 6 miesiącach po leczeniu: głębokość kieszonek dziąsłowych (PPD), poziom przyczepu klinicznego (CAL), recesja dziąseł (GR), krwawienie podczas sondowania (BOP) i O´ Indeks płytki Leary'ego (PI).19 Dodatkowo czułość korzeni (RS) oceniano za pomocą wizualnej skali analogowej (VAS) o długości 100 mm (0 oznacza brak bólu, 50 oznacza średni ból, a 100 oznacza ból nie do zniesienia) po 24 godzinach, 6 tygodniach, 3 miesiącach i 6 miesięcy po leczeniu. Obliczono zmianę PPD, CAL, GR, BOP, PI i RS (różnica między pomiarami wyjściowymi oraz po 1, 3 i 6 miesiącach).

Pobieranie GCF Próbki GCF pobrano z najgłębszej kieszonki z każdego kwadrantu przed zarejestrowaniem pomiaru klinicznego (linia wyjściowa oraz 6 tygodni i 3 miesiące po leczeniu) w celu oceny stężenia Porphyromona gingivalis (P.g), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a), Prevotella intermedia (PI) i Fusobacterium nucleatum (F.n). Obszar próbki izolowano za pomocą wacików i unikano zanieczyszczenia śliną za pomocą odpowiedniego odsysania i rozpylania powietrza. Następnie wprowadzono igłę papierową endodontyczną nr 35 do wyczucia lekkiego oporu i trzymano ją przez 30 sekund. Papierowe sączki natychmiast umieszczono w probówce Eppendorfa i przechowywano w temperaturze -80°C do przyszłej analizy.

Obróbka mikrobiologiczna Po rozmrożeniu próbek dodano 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i homogenizowano. Następnie 400 μl każdej próbki wirowano przy 13200 obr./min przez 3 minuty. Otrzymany osad zdyspergowano w 200 μl InstaGene. DNA ekstrahowano za pomocą matrycy InstaGene (Bio-Rad Life Science Research, Hercules, CA, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Pięć mikrolitrów oczyszczonego DNA wykorzystano do ilościowego oznaczenia Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum i Prevotella intermedia. Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) przeprowadzono za pomocą systemu czasu rzeczywistego CFX96 (Biorad, Hercules, CA, USA) przy użyciu metody PCR testu Taqman 5' nukleazy do wykrywania i oznaczania ilościowego bakteryjnego DNA. Reakcja Taqmana zawierała 12,5 μl Mastermix (Eurogentec, Seraing, Belgia), 4,5 μl sterylnej wody destylowanej, 1 μl zarówno starterów specyficznych dla gatunku, jak i sondy (Tabela 1) oraz 5 μl matrycowego DNA. Warunki testu dla wszystkich zestawów starterów/sond obejmowały początkowe 2 minuty w 50°C, następnie etap denaturacji przez 10 minut w 95°C, a następnie 45 cykli w 95°C przez 15 sekund i 60°C przez 60 sekund . Ocenę ilościową oparto na standardowej krzywej plazmidu. Obliczono delta dla stężenia bakterii po 6 tygodniach, 3 i 6 miesiącach (różnica między pomiarami wyjściowymi a po 6 tygodniach, 3 i 6 miesiącach).

Randomizacja, ukrywanie alokacji i kalibracja Zastosowano metodę rzutu monetą, aby przypisać ćwiartki pacjentów do dwóch grup terapeutycznych: (SRP + L-PRF) lub kontrolnej (sam SRP).

Przed przystąpieniem do badania wykonano dwie rejestracje następujących parametrów: PPD, GR i CAL u pięciu pacjentów, z 24-godzinną przerwą między pierwszym a drugim zapisem w celu sprawdzenia poprawności wewnątrzbadającej. Wszystkie zęby, z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych, mierzono za pomocą sondowania przyzębia w 6 miejscach (przyśrodkowo-policzkowe, przedpoliczkowe, mezjalno-językowe/podniebienne, przyśrodkowo-językowe/podniebienne i podjęzykowe/podniebienne). Kalibrację akceptowano, gdy pomiary na początku i po 24 godzinach mieściły się w granicach 1 mm na poziomie 95% (współczynniki korelacji między powtórzonymi pomiarami; r = 0,95).

Analiza statystyczna Aby wykryć średnią różnicę w PPD wynoszącą 1,2 mm przy odchyleniu standardowym równym 1,0 przy poziomie α równym 0,05 i poziomie β równym 0,10 (moc = 0,9), wymagana była próba licząca 10 pacjentów. Pomimo wyników, ale w celu przewidzenia potencjalnego przerwania badania w trakcie badania, rozważono wielkość próby n = 16 pacjentów.

Liczbę bakterii przekształcono logarytmicznie. Zastosowano liniowy model mieszany ze zmiennym pacjentem jako czynnikiem losowym i czasem oraz leczeniem jako dwoma skrzyżowanymi stałymi czynnikami. Palenie i PI uznano za zmienne towarzyszące. Kontrasty zostały ustawione w celu obliczenia zmiany w stosunku do linii bazowej dla różnych punktów czasowych między zabiegami i dla każdego leczenia osobno. Zastosowano poprawkę na jednoczesne testowanie hipotez według Sidaka. Utworzono normalny wykres kwantylowy i resztkowy wykres punktowy wartości resztowych, pokazując, że można przyjąć założenia leżące u podstaw modelu statystycznego.