L-PRF Plus Nechirurgické parodontální ošetření

Materiály a metody Návrh studie a výběr pacientů Byla zahájena randomizovaná kontrolovaná klinická studie s rozdělenými ústy, do které bylo zařazeno 13 pacientů (8 mužů a 5 žen, průměrný věk 52,3 ± 9,4 let). Pacienti byli informováni o výhodách a rizicích studie a každý účastník podepsal informovaný souhlas.

Nechirurgické ošetření parodontu Jediný parodontolog (L.C.) provedl všechna ošetření parodontu. NSPT sestávala ze dvou sezení škálování a hoblování kořenů (SRP) během 48 hodin v lokální anestezii za použití ultrazvukové a ruční instrumentace. Kromě toho byla místa spojená s PPD ≥ 6 mm v kvadrantu přiřazeném testovací skupině propláchnuta exsudátem L-PRF a vyplněna podélnými kusy membrány L-PRF. Pacienti obdrželi instrukce o jemné dietě, pečlivé a jemné výplachu úst chlorhexidinem 0,12% a nečistili si zuby po dobu 7 dnů, aby se zabránilo odstranění L-PRF. Po uplynutí této doby byly vydány následující pokyny: upravená technika čištění Bass, zubní nit a mezizubní kartáčky a ústní voda chlorhexidin 0,12 % na dalších 7 dní. Při každé schůzce byla také prováděna přísná hygienická kontrola ze strany lékaře.

Příprava membrány L-PRF Byly odebrány dva vzorky žilní krve do 2 zkumavek Vacutainer (červený kalíšek) o objemu 10 ml bez antikoagulantu. Byly centrifugovány při 408 g po dobu 12 minut za použití stolní centrifugy (IntraSpinTM, Intralock®, Florida, USA) podle protokolu popsaného Temmermanem et al.18. Sraženiny L-PRF byly vyjmuty ze zkumavky, odděleny od červených krvinek a umístěny do Xpression boxu (IntraSpinTM, Intralock®, Florida, USA), aby byly jemně stlačeny v membránách. Membrány byly nasekány na podélné kusy, aby se vyplnily periodontální kapsy ≥ 6 mm. Exsudát, uvolněný během komprese, nazývaný L-PRF exsudát, byl odsát k opláchnutí ošetřených kapes. (Obrázek 1)

Klinická měření Všechna klinická měření byla prováděna jediným vyškoleným a kalibrovaným zkoušejícím (N.J.), který byl maskován pro přidělenou léčbu, za použití sady základních vyšetřovacích přístrojů a University of North Carolina č. 15 barevně odlišená parodontální sonda. Následující klinické parametry byly měřeny na začátku a 6 týdnů, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě: hloubka sondy (PPD), úroveň klinického přilnutí (CAL), gingivální recese (GR), krvácení při sondování (BOP) a O' Index Learyho plaku (PI).19 Kromě toho byla vyhodnocena kořenová citlivost (RS) pomocí 100mm vizuální analogové stupnice (VAS) (0 znamená žádnou bolest, 50 znamená průměr a 100 znamená nesnesitelnou bolest) za 24 hodin, 6 týdnů, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě. Byla vypočtena změna PPD, CAL, GR, BOP, PI a RS (rozdíl mezi základními měřeními a po 1, 3 a 6 měsících).

Odběr GCF Vzorky GCF byly odebrány z nejhlubší kapsy z každého kvadrantu před záznamem klinického měření (základní hodnota a 6 týdnů a 3 měsíce po léčbě), aby se vyhodnotila koncentrace Porphyromona gingivalis (P.g), Agregatibacter aktinomycetemcomitans (A.a). Prevotella intermedia (P.i) a Fusobacterium nucleatum (F.n). Oblast vzorku byla izolována bavlněnými smotky a kontaminaci slinami bylo zabráněno pomocí vhodného odsávání a vzduchového spreje. Poté byl vložen endodontický hrot papíru č. 35, dokud neucítil mírný odpor, a držel se po dobu 30 sekund. Papírové body byly okamžitě vloženy do Eppendorfovy zkumavky a uloženy při -80 °C pro budoucí analýzu.

Mikrobiologické zpracování Po rozmrazení vzorků byl přidán 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a homogenizováno. Poté bylo 400 μl každého vzorku centrifugováno při 13200 ot./min. po dobu 3 minut. Získaná peleta byla dispergována ve 200 ul InstaGene. DNA byla extrahována matricí InstaGene (Bio-Rad Life Science Research, Hercules, CA, USA) podle pokynů výrobce. Pět mikrolitrů purifikované DNA bylo použito pro kvantifikaci Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum a Prevotella intermedia. Test kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) byl proveden pomocí systému CFX96 Real-Time System (Biorad, Hercules, CA, USA) s použitím metody Taqman 5' nukleázový test PCR pro detekci a kvantifikaci bakteriální DNA. Taqmanova reakce obsahovala 12,5 μl Mastermix (Eurogentec, Seraing, Belgie), 4,5 μl sterilní destilované vody, 1 μl obou druhově specifických primerů a sondy (Tabulka 1) a 5 μl templátové DNA. Podmínky testu pro všechny sady primer/sonda se skládaly z počátečních 2 minut při 50 °C, následovaných denaturačním krokem po dobu 10 minut při 95 °C, následovaných 45 cykly 95 °C po dobu 15 sekund a 60 °C po dobu 60 sekund . Kvantifikace byla založena na plazmidové standardní křivce. Byla vypočtena delta pro bakteriální koncentraci po 6 týdnech, 3 a 6 měsících (rozdíl mezi základními měřeními a po 6 týdnech, 3 a 6 měsících).

Randomizace, skrytí alokace a kalibrace K rozdělení kvadrantů pacientů do dvou léčebných skupin byla použita metoda hození mincí: (SRP + L-PRF) nebo kontrola (samotná SRP).

Před zahájením studie byly provedeny dva záznamy následujících parametrů: PPD, GR a CAL u pěti pacientů s 24hodinovým intervalem mezi prvním a druhým záznamem, aby se ověřila přesnost v rámci vyšetřovatele. Všechny zuby, kromě třetích molárů, byly měřeny periodontálním sondováním na 6 místech (meziobukální, mediobukální, distobukální, mesiolingvální/palatinální, mediolingvální/palatinální a distolingvální/palatinální). Kalibrace byla přijata, pokud byla měření na začátku a po 24 hodinách do 1 mm na úrovni 95 % (korelační koeficienty mezi duplicitními měřeními; r = 0,95).

Statistická analýza Pro detekci průměrného rozdílu v PPD 1,2 mm se směrodatnou odchylkou 1,0 na hladině α 0,05 a hladině β 0,10 (síla = 0,9) byl vyžadován vzorek o velikosti 10 pacientů. Navzdory výsledkům, ale pro předvídání potenciálních vyřazení během studie, byl uvažován vzorek velikosti n = 16 pacientů.

Počty bakterií byly logaritmicky transformovány. Byl aplikován lineární smíšený model s proměnným pacientem jako náhodným faktorem a časem a léčbou jako dvěma zkříženými fixními faktory. Kouření a PI byly považovány za kovariální. Byly nastaveny kontrasty pro výpočet změny od výchozí hodnoty pro různé časové body mezi ošetřeními a pro každé ošetření zvlášť. Byla použita korekce pro simultánní testování hypotéz podle Sidaka. Byl vytvořen normální kvantilový graf a zbytkový bodový graf zbytkových hodnot ukazující, že předpoklady, na nichž je založen statistický model, mohou být provedeny.