L-PRF Plus Trattamento parodontale non chirurgico

Materiali e metodi Disegno dello studio e selezione dei pazienti È stato organizzato uno studio clinico split-mouth, randomizzato controllato che ha arruolato 13 pazienti (8 maschi e 5 femmine, età media 52,3 ± 9,4 anni). I pazienti sono stati informati sui benefici e sui rischi dello studio e ciascun partecipante ha firmato il consenso informato.

Trattamento parodontale non chirurgico Un unico parodontologo (L.C.) ha eseguito tutti i trattamenti parodontali. NSPT consisteva in due sessioni di ridimensionamento e levigatura radicolare (SRP) entro 48 ore in anestesia locale utilizzando strumenti a ultrasuoni e manuali. Inoltre, i siti associati a PPD ≥ 6 mm nel quadrante assegnato al gruppo di test sono stati irrigati con essudato L-PRF e riempiti con pezzi longitudinali di membrana L-PRF. I pazienti hanno ricevuto istruzioni su una dieta morbida, un accurato e morbido risciacquo della bocca con clorexidina 0,12% e nessuna pulizia dei denti per 7 giorni per evitare la rimozione di L-PRF. Dopo questo periodo, sono state fornite le seguenti istruzioni: tecnica di spazzolamento Bass modificata, filo interdentale e spazzolini interdentali e collutorio con clorexidina 0,12% per altri 7 giorni. In ogni appuntamento è stato eseguito anche un rigoroso controllo igienico da parte del medico.

Preparazione della membrana L-PRF Due campioni di sangue venoso sono stati raccolti in 2 provette vacutainer (tazza rossa) da 10 ml senza anticoagulante. Sono stati centrifugati a 408 g per 12 minuti utilizzando una centrifuga da tavolo (IntraSpinTM, Intralock®, Florida, USA) secondo il protocollo descritto da Temmerman et al.18 I coaguli di L-PRF sono stati rimossi dalla provetta, separati dai globuli rossi e posti nella scatola Xpression (IntraSpinTM, Intralock®, Florida, USA) per comprimerli delicatamente nelle membrane. Le membrane sono state tagliate in pezzi longitudinali per riempire le tasche parodontali ≥ 6 mm. L'essudato rilasciato durante la compressione, chiamato essudato L-PRF, è stato aspirato per sciacquare le tasche trattate. (Figura 1)

Misurazioni cliniche Tutte le misurazioni cliniche sono state eseguite da un singolo esaminatore addestrato e calibrato (N.J.) che era mascherato per il trattamento assegnato, utilizzando un kit di strumenti per esami di base e una University of North Carolina n. 15 sonda parodontale codificata a colori. I seguenti parametri clinici sono stati misurati al basale e 6 settimane, 3 mesi e 6 mesi dopo il trattamento: profondità della tasca al sondaggio (PPD), livello di attacco clinico (CAL), recessione gengivale (GR), sanguinamento al sondaggio (BOP) e O' Indice di placca di Leary (PI).19 Inoltre, la sensibilità della radice (RS) è stata valutata utilizzando una scala analogica visiva (VAS) di 100 mm (0 indica nessun dolore, 50 indica la media e 100 indica un dolore insopportabile) a 24 ore, 6 settimane, 3 mesi e 6 mesi dopo il trattamento. Sono state calcolate le variazioni di PPD, CAL, GR, BOP, PI e RS (differenza tra le misure al basale ea 1, 3 e 6 mesi).

Raccolta GCF I campioni GCF sono stati prelevati dalla tasca più profonda di ciascun quadrante prima di registrare la misurazione clinica (basale e 6 settimane e 3 mesi dopo il trattamento) al fine di valutare la concentrazione di Porphyromona gingivalis (P.g), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a), Prevotella intermedia (P.i) e Fusobacterium nucleatum (F.n). L'area del campione è stata isolata con rulli di cotone e la contaminazione con la saliva è stata evitata utilizzando un'aspirazione appropriata e uno spray ad aria. Quindi, è stata inserita una punta di carta endodontica n. 35 fino a quando non si è avvertita una leggera resistenza ed è stata tenuta per 30 secondi. Le punte di carta sono state immediatamente inserite in una provetta Eppendorf e conservate a -80ºC per future analisi.

Elaborazione microbiologica Dopo lo scongelamento dei campioni, è stato aggiunto e omogeneizzato 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Quindi, 400 μl di ciascun campione sono stati centrifugati a 13200 rpm per 3 minuti. Il pellet ottenuto è stato disperso in 200 μl di InstaGene. Il DNA è stato estratto con la matrice InstaGene (Bio-Rad Life Science Research, Hercules, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Cinque microlitri del DNA purificato sono stati utilizzati per la quantificazione di Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum e Prevotella intermedia. Un'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) è stata eseguita con un sistema in tempo reale CFX96 (Biorad, Hercules, CA, USA) utilizzando il metodo PCR Taqman 5' nuclease assay per il rilevamento e la quantificazione del DNA batterico. La reazione di Taqman conteneva 12,5 μl di Mastermix (Eurogentec, Seraing, Belgio), 4,5 μl di acqua distillata sterile, 1 μl di primer e sonda specifici per specie (Tabella 1) e 5 μl di DNA modello. Le condizioni di analisi per tutti i set di primer/sonda consistevano in 2 min iniziali a 50°C, seguiti da una fase di denaturazione per 10 min a 95°C, seguita da 45 cicli di 95°C per 15 sec e 60°C per 60 sec . La quantificazione era basata su una curva standard del plasmide. È stato calcolato il delta per la concentrazione batterica a 6 settimane, 3 e 6 mesi (differenza tra le misure al basale e a 6 settimane, 3 e 6 mesi).

Randomizzazione, occultamento dell'allocazione e calibrazione È stato utilizzato un metodo di lancio della moneta per assegnare i quadranti dei pazienti in due gruppi di trattamento: (SRP + L-PRF) o controllo (solo SRP).

Prima di iniziare lo studio, sono state effettuate due registrazioni dei seguenti parametri: PPD, GR e CAL in cinque pazienti, con un intervallo di 24 ore tra la prima e la seconda registrazione per convalidare l'accuratezza intra-esaminatore. Tutti i denti, esclusi i terzi molari, sono stati misurati mediante sondaggio parodontale in 6 siti (mesiobuccale, mediobuccale, distobuccale, mesiolinguale/palatale, mediolinguale/palatale e distolinguale/palatale). La calibrazione è stata accettata se le misurazioni al basale e dopo 24 ore erano entro 1 mm al livello del 95% (coefficienti di correlazione tra misurazioni duplicate; r = 0,95).

Analisi statistica Per rilevare una differenza media nella PPD di 1,2 mm con una deviazione standard di 1,0 a un livello α di 0,05 e un livello β di 0,10 (potenza = 0,9), è stata richiesta una dimensione del campione di 10 pazienti. Nonostante i risultati, ma per anticipare potenziali abbandoni durante lo studio, è stato considerato un campione di n = 16 pazienti.

I conteggi batterici sono stati log-trasformati. È stato applicato un modello misto lineare con la variabile paziente, come fattore casuale e tempo e trattamento come due fattori fissi incrociati. Il fumo e PI sono stati considerati come covariabili. I contrasti sono stati impostati per calcolare la variazione rispetto al basale per i diversi punti temporali tra i trattamenti e per ciascun trattamento a parte. È stata applicata una correzione per il test simultaneo di ipotesi secondo Sidak. Sono stati creati un grafico quantile normale e un grafico a punti residui dei valori residui che mostrano che è possibile formulare le ipotesi alla base del modello statistico.