白细胞分类计数和 Covid-19 诊断

介绍。 2020 年 6 月 3 日，意大利政府启动了所谓的“第二阶段”，其中包括重新开放工作和社会活动。 在此框架下，如何识别无症状个体可能会在不知不觉中传播 SARS-CoV-2 感染并对公众健康构成威胁的问题已在全球范围内提出。 全世界的人口现在正处于大流行的第 3 阶段，感染的传播和新病例的发生迅速增加。 现在当务之急是确保被召回工作人员的健康和安全，并在商业和会议场所制定安全协议，这意味着防止感染者引发新的流行病爆发。 为此，需要一个完善的大规模筛查计划来满足以下几个需求：首先，它应该在几分钟内提供结果，它应该很容易在领土上交付，非医疗保健专业人员应该在一个简单的方式也应该是非侵入性的、可重复的和可靠的。

迄今为止，SARS-CoV-2 感染的诊断是通过识别通过鼻咽拭子或其他呼吸道样本收集的样本中的病毒 RNA 来进行的。 然而，这项技术在大规模筛查中的应用有几个局限性，其中最重要的是诊断所需的时间、指定分析标本的中心拥挤，以及不可忽视的病毒传播风险给医护人员。

具有快速周转时间的即时检测将允许在需要快速做出患者管理和感染控制决策的环境中进行更有效的分类。

最近，开发了一种新方法，可以检测严重 Sar-COV-2 感染和由此产生的 COVID-19 的发生，检测白细胞水平的早期升高，白细胞水平具有一组特征性的白细胞类型比率，可以识别病毒病原体并将其与其他一些区分开来。 该测试允许根据全血细胞计数结果预测阳性，比实时定量 PCR (RT-qPCR) 提前 14 天敏感，成本至少比 RT-qPCR 和抗体等其他测试低一个数量级测试。

研究的目的。 诊断准确性研究的主要目的是验证使用即时护理特征分类白细胞计数 (CLDC) 设备和算法来检测有症状和无症状个体的 SARS-CoV-2 感染，作为大规模检测的初步方法筛选程序。 比较以鼻咽拭子分子检测为代表，这是COVID-19诊断的金标准，用于算法验证和库尔特HMX的血液学细胞计数分析，贝克曼库尔特用于设备验证。

次要目标是确定与拭子分子检测相比，CLCD 方法是否能够更早地检测出 SARS-CoV-2 感染，并对所有双阳性患者进行接触者追踪研究，以估计他们的原始感染日期，以确定感染曲线测试对初始感染的敏感性。

方法。 接受鼻咽拭子程序以诊断 SARS-CoV-2 感染的受试者将在意大利波齐利的 IRCCS Neuromed 临床实验室和意大利阿韦利诺的 Diagnostica Medica Spa 连续招募。 将对 Sar-Cov-2 感染低风险和高风险的受试者进行检测：医护人员、因 COVID-19 或其他传染病以外的原因而选择性住院的患者、与受感染患者有直接接触的人员。

在早上鼻咽拭子程序的同时，每个招募的受试者也将使用 CLDC 设备和算法（CLCD 2）进行测试。 在自愿的基础上，受试者还将接受抽血（3 毫升），用于库尔特 HMX、贝克曼库尔特的血液细胞计数分析，并将仅使用 CLDC 算法（CLCD 1）进行测试。

结果评估员是盲的，因为 rRT-PCR 分析的结果至少需要 6 小时才能获得。 研究人员将对 COVID 19 症状和风险因素以及接触者追踪（日、模式）进行问卷调查 受试者在任一 CLDC 测试中呈阳性但在拭子上呈阴性将在自愿的基础上在 2、5 和可能 8 后进行新的拭子测试天，如果仍然是负面的。

独立的盲法临床医生通过实时逆转录 (rRT)-PCR，将根据国际指南分析鼻咽拭子。

对于设备验证，全血计数 (FBC) 将通过测量全血计数并将结果输入 Medichain CLDC-1 门户进行快速分析以及通过连接到智能手机的即时护理设备（ Medichain CLDC-2 智能手机显微镜 - Adstock 测试）。

Medichain CLDC-2 智能手机显微镜是一种夹在标准智能手机上的设备，将用于分析在相差模式下照明的显微镜载玻片（第 2 版 - Adstock 测试）上涂抹的约 1µl 血滴。 然后图像将从设备发送到 Medichain，以便在英国的服务器上进行分析和手动交叉检查。

然后，能够测量输入特定 FBC 参数的预备算法 Athena S3ER 分析来自该结果的数据并返回输出；考虑到感染开始时特定 FBC 参数数量的异常发生。 这项研究的基本测试门户（称为 S3ER 算法）位于 http://cldc.medichain.online。 首选的扩展门户网站是位于 http://cldc.medichain.online/research 的研究门户网站 鼻咽拭子分析。 样品将在 90 °C 下进行 1 分钟的病毒热灭活。 使用 Abbott mSample Preparation System（Promega 公司）和自动提取系统（Extraction m2000SP，Abbott Molecular）从鼻咽拭子中提取 RNA。 提取的 RNA 将使用 GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR 试剂盒（ELITechGroup）进行扩增，这是一种针对 SARS-CoV-2 RdRp、E 和 N 基因的一步式 rRT-PCR 系统。 所有招募的受试者都将接受鼻咽拭子检查，因此将不存在部分验证偏差。 CLDC测试和鼻咽拭子程序将同时进行，以避免疾病进展偏倚。 由于 CLCD 测试和鼻咽拭子由独立的盲法临床医生分析，因此在解释拭子的 rate-PCR 结果时将避免信息偏差。 指标检验完全独立于参考检验，避免了Incorporation bias。 不确定的结果将被记录下来。

样本量和统计分析。 COVID-19 的阳性发生率目前估计在普通人群中为 15%，在高危人群中为 20%。 因此，它估计在 1000 名处于不同感染风险的受试者中会发现 150 到 200 个阳性。

样本量为 1000 且鼻咽拭子阳性率为 15% 时，足以估计灵敏度约为 0.75，95% 置信区间的精度为 0.15，功效为 0.8。

合格参与者的人口统计学和临床​​特征将分别使用连续变量和离散变量的平均比例和标准比例，或绝对频率和相对频率进行总结。 仅出于描述性目的，还将在阳性和阴性鼻咽拭子受试者中报告相同的统计分析。 如果测试出现技术故障且无法重复该程序，则参与者将被排除在进一步分析之外。 在其他受试者中，与鼻咽拭子（参考测试 1）或 FBC（参考测试 2）相比，CLDC（指数测试）的敏感性和特异性将被估计，并且它们的 95% 置信区间将根据精确的二项分布。 这些分析也将根据主要主题特征进行复制。 参与者将根据阳性 CLDC-PCR、CLDC-FBC 结果的流行率来表征真阳性 (TP)、假阳性 (FP) 以及假阴性 (FN) 和真阴性 (TN)。 TP、FP、FN 和 TN 之间无差异的空关联将使用 Kruskal-Wallis 检验进行检验。