Differentiel leukocyttal og Covid-19 diagnose

Introduktion. Den 3. juni 2020 startede den italienske regering den såkaldte "Fase 2", som omfattede genåbning af arbejds- og sociale aktiviteter. I denne ramme er spørgsmålet om, hvordan man identificerer de asymptomatiske individer, som uforvarende kan sprede SARS-CoV-2-infektion og udgøre en trussel mod folkesundheden, blevet rejst verden over. Den globale befolkning oplever nu fase 3 af pandemien med en hurtig stigning i smittespredning og forekomst af nye tilfælde. Det er nu bydende nødvendigt at garantere sundheden og sikkerheden for de mennesker, der kaldes tilbage på arbejde, og at skabe en sikkerhedsprotokol i kommercielle og mødelokaler, hvilket betyder at forhindre, at inficerede mennesker forårsager nye epidemiske udbrud. Til dette formål kræves der et veletableret massescreeningsprogram for at imødekomme flere behov: for det første skal det give resultatet på få minutter, det skal nemt leveres på området, ikke-medicinsk sundhedspersonale skal udføre det på en enkel måde måde også, og bør være ikke-invasiv, gentagelig og pålidelig.

Til dato er diagnosen SARS-CoV-2-infektion stillet ved at identificere det virale RNA i prøver indsamlet gennem en nasopharyngeal podning eller andre respiratoriske prøver. Denne teknik har dog adskillige begrænsninger for dens anvendelse i en massescreening, blandt hvilke de vigtigste er den tid, der er nødvendig for diagnosen, trængselen af ​​de centre, der er udpeget til at analysere prøverne, og den ikke ubetydelige risiko for virusoverførsel til sundhedspersonalet.

Point-of-care test med hurtige ekspeditionstider ville muliggøre mere effektiv triage i omgivelser, hvor beslutninger om patientstyring og infektionskontrol skal træffes hurtigt.

For nylig er det blevet udviklet en ny metode til at frikende forekomsten af ​​alvorlig Sar-COV-2-infektion og resulterende COVID-19, påvisning af den tidlige stigning i leukocytniveauer, som har et karakteristisk sæt forhold mellem leukocyttyper, som identificerer det virale patogen og adskille den fra en række andre. Denne test giver mulighed for at forudsige positive resultater fra resultater af fuld blodtælling, følsomme op til 14 dage tidligere end real-time kvantitativ PCR (RT-qPCR), til en pris, der er mindst en størrelsesorden lavere end andre tests såsom RT-qPCR og antistof tests.

Formålet med undersøgelsen. Det primære formål med undersøgelsen af ​​diagnostisk nøjagtighed er at validere brugen af ​​den point-of-care karakteristiske Differential Leucocyte Count (CLDC) enhed og algoritme til at påvise SARS-CoV-2 infektion hos både symptomatiske og asymptomatiske individer som en foreløbig tilgang til en masse screeningsprogram. Sammenligningen er repræsenteret ved molekylær testning af nasopharyngeal podning, guldstandarden for COVID-19-diagnose, til algoritmevalidering og hæmatologiske cytometriske analyser af Coulter HMX, Beckman Coulter, til enhedsvalidering.

Sekundære mål er at definere, om CLCD-metoder er i stand til at detektere SARS-CoV-2-infektion tidligere sammenlignet med molekylær testning af podninger og at udføre en kontaktsporingsundersøgelse på alle dobbeltpositive patienter for at estimere deres oprindelige infektionsdato for at bestemme kurven for test følsomhed over for initial infektion.

Metoder. Forsøgspersoner, der gennemgår en nasopharyngeal podningsprocedure til diagnosticering af SARS-CoV-2-infektion, vil fortløbende blive rekrutteret til Clinic Laboratory of IRCCS Neuromed i Pozzilli og Diagnostica Medica Spa i Avellino, Italien. Forsøgspersoner med lav og høj risiko for Sar-Cov-2-infektion vil blive testet: sundhedspersonale, patienter, der skal indlægges elektivt af andre årsager end COVID-19 eller anden smitsom sygdom, personer, der har haft direkte kontakt med inficerede patienter.

Samtidig med proceduren for nasopharyngeal podning om morgenen vil hvert rekrutteret forsøgsperson også blive testet ved hjælp af CLDC-enhed og algoritme (CLCD 2). På frivillig basis vil forsøgspersoner også gennemgå blodprøvetagning (3 ml) til hæmatologiske cytometriske analyser af Coulter HMX, Beckman Coulter og vil blive testet udelukkende ved hjælp af CLDC-algoritme (CLCD 1).

Resultatbedømmerne er blindede, da resultaterne af rRT-PCR-analysen kræver mindst 6 timer, før de er tilgængelige. Forskningspersonale vil administrere et spørgeskema om COVID 19-symptomer og risikofaktorer og for kontaktsporing (dag, tilstand) Forsøgspersoner, der tester positive på enten CLDC-test, men negative ved podningen, vil på frivillig basis gennemgå ny podningstest efter to, 5 og muligvis 8. dage, hvis stadig negativ.

Uafhængige blindede klinikere vil gennem real-time revers transcription (rRT)-PCR analysere den nasopharyngeale podning i overensstemmelse med de internationale retningslinjer.

Til enhedsvalidering vil fuldblodtælling (FBC) blive analyseret både ved måling af fuldblodtælling og indtastning af resultaterne i Medichain CLDC-1-portalen til hurtig analyse og gennem plejestedet, der er tilsluttet smarttelefonen (den Medichain CLDC-2 smartphonemikroskop - Adstock-testen).

Medichain CLDC-2-smartphonemikroskopet, en enhed, der clipses fast på en standardsmartphone, vil blive brugt til at analysere bloddråber på ca. 1 µl smurt på et objektglas (version 2 - Adstock Test) oplyst i fasekontrasttilstand. Billeder vil derefter blive sendt fra enhederne til Medichain til analyse på servere i Storbritannien og manuel krydstjek.

Derefter analyserer en forberedende algoritme Athena S3ER, der er i stand til at måle inputspecifikke FBC-parametre, data fra dette resultat og returnerer et output; under hensyntagen til unormal forekomst i antallet af specifikke FBC-parametre ved begyndelsen af ​​infektionen. Den grundlæggende testportal for denne undersøgelse (kendt som S3ER-algoritmen) ville være på http://cldc.medichain.online. Den foretrukne udvidede portal er forskningsportalen på http://cldc.medichain.online/research Nasopharyngeal podningsanalyse. Prøver vil blive udsat for viral termisk inaktivering i 1 minut ved 90 °C. RNA-ekstraktion fra nasopharyngeal podning vil blive udført med Abbott mSample Preparation System (Promega corporation) og et automatiseret ekstraktionssystem (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Det ekstraherede RNA vil blive amplificeret med GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR-kit (ELITechGroup), et et-trins rRT-PCR-system rettet mod SARS-CoV-2 RdRp-, E- og N-gener. Alle rekrutterede forsøgspersoner vil gennemgå en nasopharyngeal podning, således at partiel verifikationsbias vil være fraværende. CLDC-testen og nasopharyngeale podningsprocedurer vil blive udført på samme tidspunkt for at undgå skævhed for sygdomsprogression. Da det er CLCD-testen og den nasopharyngeale podning analyseret af uafhængige blindede klinikere, vil informationsbias undgås ved fortolkning af rate-PCR-resultaterne af podningen. Indekstesten er fuldstændig uafhængig af referencetesten, så for at undgå Incorporation bias. Inkonklusive resultater vil blive registreret.

Prøvestørrelse og statistisk analyse. Forekomsten af ​​positivitet for COVID-19 er i øjeblikket estimeret til 15 % i den generelle befolkning og 20 % hos højrisikopersoner. Derfor estimerer den at finde mellem 150 og 200 positive i en population på 1000 forsøgspersoner med forskellig risiko for infektion.

En prøvestørrelse på 1000 med en prævalens på 15 % af positive nasopharyngeale podninger ville være tilstrækkelig til at estimere en følsomhed på omkring 0,75 med en præcision på 0,15 for 95 % konfidensintervallet og en styrke på 0,8.

Demografiske og kliniske træk ved de kvalificerede deltagere vil blive opsummeret ved at bruge middel- og standardandel eller absolutte og relative frekvenser for henholdsvis kontinuerte og diskrete variabler. Kun til beskrivende formål vil de samme statistiske analyser også blive rapporteret hos positive og negative patienter med nasopharyngeal podning. I tilfælde af teknisk fejl i test uden mulighed for at gentage proceduren, vil deltagerne blive udelukket fra yderligere analyser. Hos de andre forsøgspersoner vil sensitiviteten og specificiteten for CLDC (indekstest) sammenlignet med nasopharyngeal podning (referencetest 1) eller FBC (referencetest 2) blive estimeret, og deres 95 % konfidensinterval vil blive beregnet ud fra nøjagtig binomial fordeling. Disse analyser vil også blive replikeret i henhold til hovedfagskarakteristika. Deltagerne vil blive karakteriseret som sande positive (TP), falske positive (FP), såvel som falske negative (FN) og sande negative (TN), hvad angår prævalensen af ​​positive CLDC-PCR, CLDC-FBC resultater. Nulforeningen af ​​ingen forskel på tværs af TP, FP, FN og TN vil teste ved hjælp af en Kruskal-Wallis-test.