Różnicowa liczba leukocytów i diagnoza Covid-19

Wstęp. 3 czerwca 2020 r. włoski rząd rozpoczął tzw. „Fazę 2”, która obejmowała ponowne otwarcie działalności pracowniczej i socjalnej. W tym kontekście na całym świecie podniesiono kwestię identyfikacji osób bezobjawowych, które nieświadomie mogą przenosić zakażenie SARS-CoV-2 i stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego. Populacja mondialna przeżywa obecnie trzecią fazę pandemii z szybkim wzrostem rozprzestrzeniania się infekcji i występowania nowych przypadków. Obecnie konieczne jest zagwarantowanie zdrowia i bezpieczeństwa osób wezwanych do pracy oraz stworzenie protokołu bezpieczeństwa w przestrzeniach handlowych i konferencyjnych, co oznacza zapobieganie wywoływaniu nowych ognisk epidemii przez zarażonych. W tym celu potrzebny jest ugruntowany program masowych badań przesiewowych, który spełnia kilka potrzeb: po pierwsze, powinien dawać wynik w ciągu kilku minut, powinien być łatwo dostarczany na terytorium, niemedyczni pracownicy służby zdrowia powinni przeprowadzać go w prosty sposób sposób również i powinien być nieinwazyjny, powtarzalny i niezawodny.

Do tej pory diagnoza zakażenia SARS-CoV-2 opiera się na identyfikacji wirusowego RNA w próbkach pobranych z wymazu z nosogardzieli lub innych próbek z dróg oddechowych. Ta technika ma jednak kilka ograniczeń w jej zastosowaniu w masowych badaniach przesiewowych, z których najważniejsze to czas potrzebny do postawienia diagnozy, zagęszczenie ośrodków wyznaczonych do analizy próbek oraz nie do pominięcia ryzyko transmisji wirusa do pracowników służby zdrowia.

Testy w miejscu opieki z krótkimi czasami realizacji umożliwiłyby skuteczniejszą segregację w miejscach, w których decyzje dotyczące zarządzania pacjentami i kontroli infekcji muszą być podejmowane szybko.

Ostatnio opracowano nową metodę unieszkodliwiania wystąpienia ciężkiego zakażenia Sar-COV-2 i wynikającego z niego COVID-19, wykrywającą wczesny wzrost poziomu leukocytów, która ma charakterystyczny zestaw proporcji typów leukocytów, które identyfikują patogen wirusowy i odróżnić go od wielu innych. Ten test umożliwia przewidywanie wyników dodatnich na podstawie wyników pełnej morfologii krwi, czułość do 14 dni wcześniej niż ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR), przy koszcie co najmniej o rząd wielkości niższym niż w przypadku innych testów, takich jak RT-qPCR i przeciwciał testy.

Cel badania. Głównym celem badania Diagnostic Accuracy jest walidacja zastosowania charakterystycznego dla punktu opieki zdrowotnej urządzenia i algorytmu różnicowej liczby leukocytów (CLDC) do wykrywania zakażenia SARS-CoV-2 zarówno u osób z objawami, jak i bezobjawowymi, jako wstępnego podejścia do masy program badań przesiewowych. Porównanie jest reprezentowane przez testy molekularne wymazu z nosogardzieli, złoty standard diagnozy COVID-19, do walidacji algorytmu oraz hematologiczne analizy cytometryczne przez Coulter HMX, Beckman Coulter, do walidacji urządzenia.

Drugorzędne cele to określenie, czy metody CLCD są w stanie wykryć zakażenie SARS-CoV-2 wcześniej w porównaniu z testami molekularnymi wymazów oraz przeprowadzenie badania śledzenia kontaktów u wszystkich podwójnie dodatnich pacjentów w celu oszacowania ich pierwotnej daty zakażenia w celu określenia krzywej test wrażliwości na początkową infekcję.

Metody. Osoby, które zostaną poddane wymazowi z jamy nosowo-gardłowej w celu rozpoznania zakażenia SARS-CoV-2, będą kolejno rekrutowane w Laboratorium Klinicznym IRCCS Neuromed w Pozzilli oraz Diagnostica Medica Spa w Avellino we Włoszech. Badanym będą osoby z grupy niskiego i wysokiego ryzyka zakażenia Sar-Cov-2: pracownicy służby zdrowia, pacjenci planowo hospitalizowani z innego powodu niż COVID-19 lub inna choroba zakaźna, osoby, które miały bezpośredni kontakt z zakażonymi pacjentami.

W tym samym czasie co rano pobrano wymaz z nosogardzieli, każdy zrekrutowany pacjent zostanie również przebadany za pomocą urządzenia i algorytmu CLDC (CLCD 2). Na zasadzie dobrowolności osoby badane zostaną również poddane pobraniu krwi (3 ml) do hematologicznych analiz cytometrycznych przez Coulter HMX, Beckman Coulter i zostaną przetestowane wyłącznie przy użyciu algorytmu CLDC (CLCD 1).

Oceniający wyniki są zaślepieni, ponieważ wyniki analizy rRT-PCR wymagają co najmniej 6 godzin, zanim będą dostępne. Personel badawczy przeprowadzi kwestionariusz dotyczący objawów i czynników ryzyka COVID 19 oraz śledzenia kontaktów (dzień, tryb). Osoby, u których wynik testu CLDC był dodatni, ale wynik ujemny wymazu, zostaną dobrowolnie poddane testowi nowego wymazu po dwóch, 5 i prawdopodobnie 8 dni, jeśli nadal jest ujemny.

Niezależni, zaślepieni klinicyści, stosując odwrotną transkrypcję w czasie rzeczywistym (rRT)-PCR, przeanalizują wymaz z nosogardzieli zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi.

W celu walidacji urządzenia, pełna morfologia krwi (FBC) zostanie przeanalizowana zarówno poprzez pomiar pełnej morfologii krwi i wprowadzenie wyników do portalu Medichain CLDC-1 w celu szybkiej analizy, jak i poprzez urządzenie przyłóżkowe podłączone do smartfona (tzw. Mikroskop smartfona Medichain CLDC-2 - test Adstock).

Mikroskop do smartfona Medichain CLDC-2, urządzenie przyczepiane do standardowego smartfona, posłuży do analizy kropli krwi o objętości około 1 µl rozmazanych na szkiełku mikroskopowym (wersja 2 - Adstock Test) oświetlonym w trybie kontrastu fazowego. Obrazy zostaną następnie przesłane z urządzeń do Medichain w celu analizy na serwerach w Wielkiej Brytanii i ręcznej kontroli krzyżowej.

Następnie algorytm przygotowawczy Athena S3ER, zdolny do pomiaru parametrów FBC specyficznych dla wejścia, analizuje dane z tego wyniku i zwraca dane wyjściowe; biorąc pod uwagę nieprawidłowe występowanie w liczbie określonych parametrów FBC na początku infekcji. Podstawowy portal testowy dla tego badania (znany jako algorytm S3ER) znajdowałby się pod adresem http://cldc.medichain.online. Preferowanym rozszerzonym portalem jest portal badawczy pod adresem http://cldc.medichain.online/research Analiza wymazu z nosogardzieli. Próbki zostaną poddane termicznej inaktywacji wirusów przez 1 minutę w temperaturze 90°C. Ekstrakcja RNA z wymazu z jamy nosowo-gardłowej zostanie przeprowadzona za pomocą systemu Abbott mSample Preparation System (Promega Corporation) i automatycznego systemu ekstrakcji (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Wyekstrahowany RNA zostanie zamplifikowany przy użyciu zestawu GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR (ELITachGroup), jednoetapowego systemu rRT-PCR ukierunkowanego na geny RdRp, E i N SARS-CoV-2. Wszyscy rekrutowani uczestnicy zostaną poddani wymazowi z nosogardzieli, w związku z czym częściowa weryfikacja zostanie wyeliminowana. Test CLDC i wymazy z jamy nosowo-gardłowej zostaną wykonane w tym samym momencie, aby uniknąć błędu związanego z progresją choroby. Ze względu na to, że test CLCD i wymaz z jamy nosowo-gardłowej są analizowane przez niezależnych, zaślepionych klinicystów, można uniknąć błędu informacyjnego podczas interpretacji wyników testu szybkości PCR wymazów. Test indeksu jest całkowicie niezależny od testu referencyjnego, aby uniknąć błędu inkorporacji. Wyniki niejednoznaczne zostaną zapisane.

Wielkość próby i analiza statystyczna. Częstość występowania COVID-19 jest obecnie szacowana na 15% w populacji ogólnej i 20% u osób z grupy wysokiego ryzyka. W związku z tym szacuje się, że w populacji 1000 osób o różnym ryzyku zakażenia znajdzie się od 150 do 200 pozytywnych wyników.

Wielkość próby 1000 z przewagą 15% dodatnich wymazów z jamy nosowo-gardłowej wystarczyłaby do oszacowania czułości około 0,75 z dokładnością 0,15 dla 95% przedziału ufności i potęgą 0,8.

Cechy demograficzne i kliniczne kwalifikujących się uczestników zostaną podsumowane przy użyciu średniej i standardowej proporcji lub bezwzględnych i względnych częstotliwości odpowiednio dla zmiennych ciągłych i dyskretnych. Wyłącznie w celach opisowych, te same analizy statystyczne zostaną przedstawione również w przypadku dodatnich i ujemnych wymazów z nosogardzieli. W przypadku technicznego niepowodzenia testów bez możliwości powtórzenia procedury, uczestnicy zostaną wykluczeni z dalszych analiz. U pozostałych pacjentów zostanie oszacowana czułość i swoistość CLDC (test wskaźnikowy) w porównaniu z wymazem z nosogardzieli (test referencyjny 1) lub FBC (test referencyjny 2), a ich 95% przedział ufności zostanie obliczony na podstawie dokładny rozkład dwumianowy. Analizy te zostaną również powtórzone zgodnie z głównymi cechami podmiotu. Uczestnicy zostaną scharakteryzowani jako prawdziwie pozytywni (TP), fałszywie pozytywni (FP), a także fałszywie negatywni (FN) i prawdziwie negatywni (TN), pod względem rozpowszechnienia pozytywnych wyników CLDC-PCR, CLDC-FBC. Zerowa asocjacja braku różnic między TP, FP, FN i TN zostanie przetestowana przy użyciu testu Kruskala-Wallisa.