Leukosyyttien erotus ja Covid-19-diagnoosi

Johdanto. Italian hallitus käynnisti 3.6.2020 niin sanotun "vaiheen 2", joka sisälsi työ- ja sosiaalisen toiminnan uudelleen avaamisen. Tässä yhteydessä maailmanlaajuisesti on nostettu esille kysymys siitä, kuinka tunnistaa oireettomat henkilöt, jotka voivat tahattomasti levittää SARS-CoV-2-tartuntaa ja muodostaa uhan kansanterveydelle. Maailman väestössä eletään nyt pandemian 3. vaihetta, jolloin tartuntojen leviäminen ja uusien tapausten ilmaantuminen lisääntyy nopeasti. Nyt on välttämätöntä taata töihin takaisin kutsuttujen ihmisten terveys ja turvallisuus sekä luoda turvallisuuspöytäkirja liike- ja kokoustiloihin, mikä tarkoittaa, että tartunnan saaneita estetään aiheuttamasta uusia epidemioita. Tätä tarkoitusta varten tarvitaan vakiintunut massaseulontaohjelma, joka täyttää useita tarpeita: ensinnäkin sen pitäisi antaa tulos muutamassa minuutissa, se on helposti toimitettava alueelle, ei-lääketieteen ammattilaisten tulisi suorittaa se yksinkertaisella ja sen pitäisi olla ei-invasiivinen, toistettavissa ja luotettava.

Tähän mennessä SARS-CoV-2-infektion diagnoosi on tehty tunnistamalla viruksen RNA näytteistä, jotka on kerätty nenänielun tai muiden hengitystienäytteiden kautta. Tällä tekniikalla on kuitenkin useita rajoituksia sen soveltamiselle massaseulonnassa, joista tärkeimmät ovat diagnoosin tekemiseen tarvittava aika, näytteiden analysointiin nimettyjen keskusten tungostuminen ja viruksen leviämisen ei-merkitty riski. terveydenhuollon työntekijöille.

Hoitopaikan testaus nopeilla läpimenoajoilla mahdollistaisi tehokkaamman lajittelun olosuhteissa, joissa potilaiden hallintaa ja infektioiden valvontaa koskevat päätökset on tehtävä nopeasti.

Äskettäin on kehitetty uusi menetelmä vakavan Sar-COV-2-infektion ja siitä seuranneen COVID-19:n esiintymisen vapauttamiseksi. Se havaitsee leukosyyttitasojen varhaisen nousun, jolla on tyypillinen joukko leukosyyttityyppien suhteita, jotka tunnistavat viruksen patogeenin. ja erottaa sen monista muista. Tämä testi mahdollistaa positiivisten tulosten ennustamisen täyden verenkuvan tuloksista, jotka ovat herkkiä jopa 14 päivää aikaisemmin kuin reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR), hintaan vähintään suuruusluokkaa alhaisemmat kuin muut testit, kuten RT-qPCR ja vasta-ainetestit. testejä.

Tutkimuksen tavoite. Diagnostisen tarkkuustutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on validoida hoitopisteelle ominaisen differentiaalisen leukosyyttien laskentalaitteen ja -algoritmin käyttö SARS-CoV-2-infektion havaitsemiseksi sekä oireettomissa että oireettomissa yksilöissä alustavana lähestymistavana massalle. seulontaohjelma. Vertailua edustaa Coulter HMX:n, Beckman Coulterin, nenänielun molekyylitestaus, COVID-19-diagnoosin kultastandardi algoritmien validoinnissa ja hematologiset sytometriset analyysit laitteen validoimiseksi.

Toissijaisena tavoitteena on määrittää, pystyvätkö CLCD-menetelmät havaitsemaan SARS-CoV-2-tartunnan aikaisemmin kuin vanupuikkomolekyylitestaukset, ja suorittaa kosketuksen jäljitystutkimus kaikille kaksoispositiivisille potilaille, jotta voidaan arvioida heidän alkuperäinen tartuntapäivänsä ja määrittää infektiokäyrä. testaa herkkyys alkuperäistä infektiota vastaan.

menetelmät. Koehenkilöt, joille tehdään nenänielun vanupuikkomenettely SARS-CoV-2-infektion diagnosoimiseksi, rekrytoidaan peräkkäin IRCCS Neuromedin klinikkalaboratorioon Pozzillissa ja Diagnostica Medica Spassa Avellinossa, Italiassa. Testataan henkilöitä, joilla on pieni ja korkea riski saada Sar-Cov-2-tartunta: terveydenhuollon työntekijät, potilaat, jotka joutuvat sairaalahoitoon muun syyn kuin COVID-19:n tai muun tartuntataudin vuoksi, henkilöt, jotka ovat olleet suorassa kontaktissa tartunnan saaneiden potilaiden kanssa.

Samanaikaisesti aamun nenänielun vanupuikkotoimenpiteen aikana jokainen rekrytoitu koehenkilö testataan myös CLDC-laitteella ja -algoritmilla (CLCD 2). Coulter HMX:n ja Beckman Coulterin suorittamia hematologisia sytometrisiä analyysejä varten koehenkilöiltä otetaan vapaaehtoisesti myös verinäyte (3 ml), ja heidät testataan käyttämällä vain CLDC-algoritmia (CLCD 1).

Tulosarvioijat ovat sokeita, koska rRT-PCR-analyysin tulokset vaativat vähintään 6 tuntia ennen kuin ne ovat saatavilla. Tutkimushenkilöstö suorittaa kyselylomakkeen COVID 19 -oireista ja -riskitekijöistä sekä kontaktien jäljittämisestä (päivä, tila) Koehenkilöille, jotka ovat positiivisia joko CLDC-testissä mutta negatiivisia vanupuikolla, tehdään vapaaehtoisesti uusi vanupuikkotesti kahden, 5 ja mahdollisesti 8 jälkeen. päivää, jos se on edelleen negatiivinen.

Riippumattomat sokkoutuneet lääkärit analysoivat reaaliaikaisen käänteisen transkription (rRT)-PCR:n avulla nenänielun vanupuikkoja kansainvälisten ohjeiden mukaisesti.

Laitteen validointia varten Full Blood Count (FBC) analysoidaan sekä mittaamalla Full Blood Count ja syöttämällä tulokset Medichain CLDC-1 -portaaliin nopeaa analyysiä varten että älypuhelimeen yhdistetyn pistelaitteen kautta ( Medichain CLDC-2 älypuhelinmikroskooppi - Adstock-testi).

Medichain CLDC-2 -älypuhelimen mikroskooppia, laitetta, joka kiinnitetään tavalliseen älypuhelimeen, käytetään analysoimaan noin 1 µl:n veripisaroita, jotka ovat levinneet vaihekontrastitilassa valaistulle mikroskoopin objektilasille (versio 2 - Adstock Test). Kuvat lähetetään sitten laitteista Medichainille analysoitavaksi Iso-Britannian palvelimilla ja manuaalista ristiintarkistusta varten.

Sitten valmisteleva algoritmi Athena S3ER, joka pystyy mittaamaan syötekohtaisia ​​FBC-parametreja, analysoi tiedot tästä tuloksesta ja palauttaa lähdön; ottaen huomioon tiettyjen FBC-parametrien epänormaali esiintyminen infektion alkaessa. Tämän tutkimuksen perustestiportaali (tunnetaan nimellä S3ER-algoritmi) on osoitteessa http://cldc.medichain.online. Suositeltu laajennettu portaali on tutkimusportaali osoitteessa http://cldc.medichain.online/research Nenänielun vanupuikkoanalyysi. Näytteet altistetaan viruksen lämpöinaktivaatiolle 1 minuutin ajan 90 °C:ssa. RNA-uutto nenänielun vanupuikoista suoritetaan Abbott mSample Preparation System -järjestelmällä (Promega Corporation) ja automaattisella uuttojärjestelmällä (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Uutettu RNA monistetaan GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR -sarjalla (ELITechGroup), yksivaiheisella rRT-PCR-järjestelmällä, joka kohdistuu SARS-CoV-2 RdRp-, E- ja N-geeneihin. Kaikille rekrytoiduille koehenkilöille tehdään nenänielun vanupuikko, joten osittaista varmennusta ei esiinny. CLDC-testi ja nenänielun vanupuikkotoimenpiteet suoritetaan samalla hetkellä taudin etenemisen vääristymisen välttämiseksi. Koska CLCD-testi ja nenänielun vanupuikko on analysoitu riippumattomien sokettujen kliinikkojen toimesta, tietoharhaa vältetään tulkittaessa pyyhkäisynäytteiden nopeus-PCR-tuloksia. Indeksitesti on täysin riippumaton vertailutestistä, jotta voidaan välttää Incorporation bias. Epäselvät tulokset kirjataan.

Otoskoko ja tilastollinen analyysi. COVID-19-positiivisuuden ilmaantuvuuden arvioidaan tällä hetkellä olevan 15 % väestöstä ja 20 % korkean riskin ihmisistä. Siksi se arvioi löytävänsä 150–200 positiivista 1000 henkilön populaatiossa, joilla on erilainen infektioriski.

Otoskoko 1000 ja esiintyvyys 15 % positiivisista nenänielun vanupuikoista riittäisi arvioimaan noin 0,75:n herkkyyden tarkkuudella 0,15 95 %:n luottamusvälillä ja teholla 0,8.

Sopivien osallistujien demografiset ja kliiniset ominaisuudet tehdään yhteenveto käyttämällä keskimääräistä ja standardisuhdetta tai absoluuttista ja suhteellista frekvenssiä jatkuville ja diskreeteille muuttujille, vastaavasti. Vain kuvaustarkoituksessa samat tilastolliset analyysit raportoidaan myös positiivisista ja negatiivisista nenänielun vanupuikkotutkimuksista. Jos testauksessa ilmenee tekninen vika ilman mahdollisuutta toistaa menettelyä, osallistujat suljetaan pois lisäanalyyseistä. Muilla koehenkilöillä CLDC:n (indeksitesti) herkkyys ja spesifisyys verrattuna nenänielun vanupuikkoon (vertailutesti 1) tai FBC:hen (vertailutesti 2) arvioidaan, ja niiden 95 %:n luottamusväli lasketaan tarkka binomijakauma. Nämä analyysit myös toistetaan pääaihepiirteiden mukaan. Osallistujat luonnehditaan todellisiksi positiivisiksi (TP), vääriksi positiivisiksi (FP) sekä vääriksi negatiivisiksi (FN) ja todellisiksi negatiivisiksi (TN) positiivisten CLDC-PCR- ja CLDC-FBC-tulosten esiintyvyyden suhteen. Nolla-assosiaatio ilman eroa TP:n, FP:n, FN:n ja TN:n välillä testataan Kruskal-Wallis-testillä.