Differensiell leukocytttelling og Covid-19 diagnose

Introduksjon. I 3. juni 2020 startet den italienske regjeringen den såkalte "Fase 2", som inkluderte gjenåpning av arbeids- og sosiale aktiviteter. I dette rammeverket har spørsmålet om hvordan man identifiserer asymptomatiske individer som uforvarende kan spre SARS-CoV-2-infeksjon og utgjøre en trussel mot folkehelsen, blitt reist over hele verden. Den globale befolkningen opplever nå fase 3 av pandemien med en rask økning i smittespredning og forekomst av nye tilfeller. Det er nå viktig å garantere helsen og sikkerheten til de som kalles tilbake til arbeid og å lage en sikkerhetsprotokoll i kommersielle og møtelokaler, som betyr å forhindre at infiserte mennesker forårsaker nye epidemiske utbrudd. For dette formålet kreves et veletablert massescreeningsprogram for å dekke flere behov: For det første skal det gi resultatet på noen få minutter, det skal enkelt leveres på territoriet, ikke-medisinsk helsepersonell bør utføre det på en enkel måte. måte også, og bør være ikke-invasiv, repeterbar og pålitelig.

Til dags dato er diagnosen SARS-CoV-2-infeksjon stilt ved å identifisere virus-RNA i prøver samlet gjennom en nasofaryngeal vattpinne eller andre luftveisprøver. Denne teknikken har imidlertid flere begrensninger for sin anvendelse i en massescreening, blant dem de viktigste er tiden som er nødvendig for diagnosen, opphopningen av de sentrene som er utnevnt til å analysere prøvene, og den ikke-ubetydelige risikoen for virusoverføring. til helsepersonell.

Point-of-care testing med raske behandlingstider vil tillate mer effektiv triage i omgivelser der pasientbehandling og infeksjonskontrollbeslutninger må tas raskt.

Nylig har det blitt utviklet en ny metode for å frikjenne forekomsten av alvorlig Sar-COV-2-infeksjon og resulterende COVID-19, og oppdage den tidlige økningen i leukocyttnivåer som har et karakteristisk sett med forhold mellom leukocytttyper, som identifiserer viruspatogenet og skille den fra en rekke andre. Denne testen gjør det mulig å forutsi positive resultater fra full blodtelling, sensitive opptil 14 dager tidligere enn sanntids kvantitativ PCR (RT-qPCR), til en kostnad som er minst en størrelsesorden lavere enn andre tester som RT-qPCR og antistoff tester.

Målet med studien. Hovedmålet med studien med diagnostisk nøyaktighet er å validere bruken av den punkt-of-care karakteristiske Differential Leucocyte Count (CLDC) enheten og algoritmen for å oppdage SARS-CoV-2-infeksjon hos både symptomatiske og asymptomatiske individer som en foreløpig tilnærming til en masse screeningprogram. Sammenligningen er representert ved molekylær testing av nasofaryngeal vattpinne, gullstandarden for COVID-19-diagnose, for algoritmevalidering og hematologiske cytometriske analyser av Coulter HMX, Beckman Coulter, for enhetsvalidering.

Sekundære mål er å definere om CLCD-metoder er i stand til å oppdage SARS-CoV-2-infeksjon tidligere sammenlignet med molekylær testing og å utføre en kontaktsporingsstudie på alle dobbeltpositive pasienter for å estimere deres opprinnelige infeksjonsdato for å bestemme kurven for test sensitivitet mot initial infeksjon.

Metoder. Personer som gjennomgår nasofaryngeal vattpinneprosedyre for diagnostisering av SARS-CoV-2-infeksjon vil bli rekruttert fortløpende ved Clinic Laboratory of IRCCS Neuromed i Pozzilli og Diagnostica Medica Spa i Avellino, Italia. Personer med lav og høy risiko for Sar-Cov-2-infeksjon vil bli testet: helsepersonell, pasienter som skal legges inn på sykehus av andre grunner enn COVID-19 eller annen smittsom sykdom, personer som har hatt direkte kontakt med infiserte pasienter.

Samtidig med prosedyren for nasofaryngeal vattpinne om morgenen, vil hvert rekruttert forsøksperson også bli testet med CLDC-enhet og algoritme (CLCD 2). På frivillig basis vil forsøkspersonene også gjennomgå blodprøvetaking (3 ml) for hematologiske cytometriske analyser av Coulter HMX, Beckman Coulter og vil bli testet med kun CLDC-algoritme (CLCD 1).

Resultatbedømmerne er blindet, siden resultatene av rRT-PCR-analysen krever minst 6 timer før de er tilgjengelige. Forskningspersonell vil administrere et spørreskjema om COVID 19-symptomer og risikofaktorer og for kontaktsporing (dag, modus) Forsøkspersoner som tester positivt på en av CLDC-testene, men negative på vattpinneprøven, vil på frivillig basis gjennomgå ny vattpinnetesting etter to, 5 og muligens 8. dager hvis fortsatt negativ.

Uavhengige blindede klinikere gjennom sanntids revers transkripsjon (rRT)-PCR, vil analysere nasopharyngeal vattpinne i henhold til internasjonale retningslinjer.

For enhetsvalidering vil Full Blood Count (FBC) bli analysert både ved å måle full Blood Count og legge inn resultatene i Medichain CLDC-1-portalen for rask analyse og gjennom punkt-of-care-enheten koblet til smarttelefonen (den Medichain CLDC-2 smarttelefonmikroskop - Adstock-testen).

Medichain CLDC-2-smarttelefonmikroskopet, en enhet som festes på en standard smarttelefon, vil bli brukt til å analysere bloddråper på omtrent 1 µl smurt på et objektglass (versjon 2 - Adstock Test) opplyst i fasekontrastmodus. Bilder vil deretter bli sendt fra enhetene til Medichain for analyse på servere i Storbritannia og manuell krysssjekking.

Deretter analyserer en forberedende algoritme Athena S3ER som er i stand til å måle inngangsspesifikke FBC-parametere data fra dette resultatet og returnerer en utgang; tar hensyn til unormal forekomst i antall spesifikke FBC-parametere ved begynnelsen av infeksjonen. Den grunnleggende testportalen for denne studien (kjent som S3ER-algoritmen) vil være på http://cldc.medichain.online. Den foretrukne utvidede portalen er forskningsportalen på http://cldc.medichain.online/research Nasofaryngeal vattpinneanalyse. Prøver vil bli utsatt for viral termisk inaktivering i 1 minutt ved 90 °C. RNA-ekstraksjon fra nasopharyngeal vattpinne vil bli utført med Abbott mSample Preparation System (Promega corporation) og et automatisert ekstraksjonssystem (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Det ekstraherte RNAet vil bli amplifisert med GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR-sett (ELITechGroup), et ett-trinns rRT-PCR-system rettet mot SARS-CoV-2 RdRp-, E- og N-gener. Alle rekrutterte forsøkspersoner vil gjennomgå nasofaryngeal vattpinne, og dermed vil delvis verifiseringsskjevhet være fraværende. CLDC-testen og prosedyrene for nasofaryngeal vattpinne vil bli utført i samme øyeblikk for å unngå skjevhet i sykdomsprogresjon. Siden CLCD-testen og nasofaryngeal vattpinne analyseres av uavhengige blindede klinikere, vil informasjonsskjevhet unngås ved tolkning av rate-PCR-resultatene til vattpinneprøvene. Indekstesten er helt uavhengig av referansetesten, for å unngå Incorporation bias. Inkonklusive resultater vil bli registrert.

Prøvestørrelse og statistisk analyse. Forekomsten av positivitet for COVID-19 er for tiden estimert til 15 % i befolkningen generelt og 20 % hos høyrisikopersoner. Derfor anslår den å finne mellom 150 og 200 positive i en populasjon på 1000 personer med ulik risiko for infeksjon.

En prøvestørrelse på 1000 med en prevalens på 15 % av positive nasofaryngeale vattpinner vil være tilstrekkelig for å estimere en sensitivitet på rundt 0,75 med en presisjon på 0,15 for 95 % konfidensintervall og en styrke på 0,8.

Demografiske og kliniske trekk ved de kvalifiserte deltakerne vil bli oppsummert ved å bruke gjennomsnittlig og standardandel, eller absolutte og relative frekvenser, for henholdsvis kontinuerlige og diskrete variabler. Bare for beskrivende formål vil de samme statistiske analysene bli rapportert også hos positive og negative pasienter med nasofaryngeal vattpinne. Ved teknisk feil i testingen uten mulighet for å gjenta prosedyren, vil deltakerne bli ekskludert fra videre analyser. Hos de andre forsøkspersonene vil sensitiviteten og spesifisiteten for CLDC (indekstest) sammenlignet med nasopharyngeal vattpinne (referansetest 1) eller FBC (referansetest 2) bli estimert, og deres 95 % konfidensintervall vil bli beregnet fra eksakt binomialfordeling. Disse analysene vil også bli replikert i henhold til hovedfagskjennetegn. Deltakerne vil karakteriseres som sanne positive (TP), falske positive (FP), samt falske negative (FN) og sanne negative (TN), når det gjelder prevalens av positive CLDC-PCR-, CLDC-FBC-resultater. Nullassosiasjonen av ingen forskjell på tvers av TP, FP, FN og TN vil teste med en Kruskal-Wallis-test.