Numération différentielle des leucocytes et diagnostic du Covid-19

Introduction. Le 3 juin 2020, le gouvernement italien a lancé la soi-disant "Phase 2", qui comprenait la réouverture des activités de travail et sociales. Dans ce cadre, la question de savoir comment identifier les individus asymptomatiques qui, à leur insu, peuvent propager l'infection par le SRAS-CoV-2 et constituer une menace pour la santé publique a été soulevée dans le monde entier. La population mondiale vit actuellement la phase 3 de la pandémie avec une augmentation rapide de la propagation de l'infection et de la survenue de nouveaux cas. Il est désormais impératif de garantir la santé et la sécurité des personnes rappelées au travail et de créer un protocole de sécurité dans les espaces commerciaux et de réunion, ce qui signifie empêcher les personnes infectées de provoquer de nouvelles flambées épidémiques. Pour cela, un programme de dépistage de masse bien rodé est nécessaire pour répondre à plusieurs besoins : premièrement, il doit fournir le résultat en quelques minutes, il doit être facilement délivré sur le territoire, les professionnels de santé non médicaux doivent le réaliser dans un délai simple façon aussi, et devrait être non invasif, reproductible et fiable.

À ce jour, le diagnostic d'infection par le SRAS-CoV-2 est posé en identifiant l'ARN viral dans des échantillons prélevés par écouvillonnage nasopharyngé ou d'autres échantillons respiratoires. Cette technique présente cependant plusieurs limites pour son application dans un dépistage de masse, parmi lesquelles les plus importantes sont le temps nécessaire au diagnostic, l'encombrement des centres désignés pour analyser les prélèvements et le risque non négligeable de transmission virale. aux travailleurs de la santé.

Des tests au point de service avec des délais d'exécution rapides permettraient un triage plus efficace dans les contextes où les décisions en matière de gestion des patients et de contrôle des infections doivent être prises rapidement.

Récemment, il a été développé une nouvelle méthode d'acquittement de l'apparition d'une infection grave au Sar-COV-2 et du COVID-19 qui en résulte, détectant l'augmentation précoce des taux de leucocytes qui présente un ensemble caractéristique de rapports de types de leucocytes, qui identifient l'agent pathogène viral et le distinguer de plusieurs autres. Ce test permet de prédire les résultats positifs à partir des résultats de la formule sanguine complète, sensible jusqu'à 14 jours plus tôt que la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR), à un coût d'au moins un ordre de grandeur inférieur à celui d'autres tests tels que la RT-qPCR et les anticorps essais.

Le but de l'étude. L'objectif principal de l'étude Diagnostic Accuracy est de valider l'utilisation du dispositif et de l'algorithme de numération différentielle des leucocytes (CLDC) caractéristiques au point de service pour détecter l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les individus symptomatiques et asymptomatiques comme approche préliminaire d'une masse programme de dépistage. La comparaison est représentée par le test moléculaire sur écouvillon nasopharyngé, l'étalon-or du diagnostic COVID-19, pour la validation de l'algorithme et les analyses cytométriques hématologiques par Coulter HMX, Beckman Coulter, pour la validation de l'appareil.

Les objectifs secondaires sont de définir si les méthodes CLCD sont capables de détecter l'infection par le SRAS-CoV-2 plus tôt par rapport aux tests moléculaires sur écouvillon et d'effectuer une étude de recherche des contacts sur tous les patients doublement positifs pour estimer leur date d'infection initiale afin de déterminer la courbe de tester la sensibilité à l'infection initiale.

Méthodes. Les sujets qui subissent la procédure d'écouvillonnage nasopharyngé pour le diagnostic de l'infection par le SRAS-CoV-2 seront recrutés consécutivement au laboratoire clinique de l'IRCCS Neuromed à Pozzilli et à Diagnostica Medica Spa à Avellino, en Italie. Les sujets à faible et haut risque d'infection par le Sar-Cov-2 seront testés : les travailleurs de la santé, les patients devant être hospitalisés électivement pour une raison autre que le COVID-19 ou une autre maladie infectieuse, les personnes qui ont été en contact direct avec des patients infectés.

En même temps que la procédure d'écouvillonnage nasopharyngé le matin, chaque sujet recruté sera également testé à l'aide du dispositif et de l'algorithme CLDC (CLCD 2). Sur une base volontaire, les sujets subiront également une prise de sang (3 ml) pour des analyses cytométriques hématologiques par Coulter HMX, Beckman Coulter et seront testés en utilisant uniquement l'algorithme CLDC (CLCD 1).

Les évaluateurs des résultats sont en aveugle, car les résultats de l'analyse rRT-PCR nécessitent au moins 6 heures avant d'être disponibles. Le personnel de recherche administrera un questionnaire sur les symptômes et les facteurs de risque du COVID 19 et pour la recherche des contacts (jour, mode). jours si toujours négatif.

Des cliniciens indépendants en aveugle par transcription inverse en temps réel (rRT)-PCR analyseront l'écouvillon nasopharyngé conformément aux directives internationales.

Pour la validation de l'appareil, la numération globulaire complète (FBC) sera analysée à la fois en mesurant la numération globulaire complète et en saisissant les résultats dans le portail Medichain CLDC-1 pour une analyse rapide et via le dispositif de point de service connecté au smartphone (le Microscope pour smartphone Medichain CLDC-2 - le test Adstock).

Le microscope pour smartphone Medichain CLDC-2, un appareil qui se clipse sur un smartphone standard, permettra d'analyser des gouttes de sang d'environ 1µl maculées sur une lame de microscope (version 2 - Adstock Test) éclairée en mode contraste de phase. Les images seront ensuite envoyées des appareils à Medichain pour analyse sur des serveurs au Royaume-Uni et recoupement manuel.

Ensuite, un algorithme préparatoire Athena S3ER capable de mesurer les paramètres FBC spécifiques d'entrée analyse les données de ce résultat et renvoie une sortie ; en tenant compte de l'occurrence anormale du nombre de paramètres FBC spécifiques au début de l'infection. Le portail de test de base pour cette étude (connu sous le nom d'algorithme S3ER) serait à http://cldc.medichain.online. Le portail étendu préféré est le portail de recherche sur http://cldc.medichain.online/research Analyse d'écouvillon nasopharyngé. Les échantillons seront soumis à une inactivation thermique virale pendant 1 minute à 90 °C. L'extraction de l'ARN de l'écouvillon nasopharyngé sera effectuée avec le système de préparation Abbott mSample (Promega corporation) et un système d'extraction automatisé (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). L'ARN extrait sera amplifié avec le kit GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR (ELITechGroup), un système rRT-PCR en une étape ciblant les gènes SARS-CoV-2 RdRp, E et N. Tous les sujets recrutés subiront l'écouvillonnage nasopharyngé, donc le biais de vérification partielle sera absent. Le test CLDC et les procédures d'écouvillonnage nasopharyngé seront effectués au même moment pour éviter le biais de progression de la maladie. Étant donné que le test CLCD et l'écouvillon nasopharyngé sont analysés par des cliniciens indépendants en aveugle, le biais d'information sera évité lors de l'interprétation des résultats de taux-PCR des écouvillons. Le test d'indice est totalement indépendant du test de référence, afin d'éviter le biais d'incorporation. Les résultats non concluants seront enregistrés.

Taille de l'échantillon et analyse statistique. L'incidence de la positivité au COVID-19 est actuellement estimée à 15 % dans la population générale et à 20 % chez les personnes à haut risque. Par conséquent, il estime trouver entre 150 et 200 positifs dans une population de 1000 sujets à différents risques d'infection.

Une taille d'échantillon de 1000 avec une prévalence de 15 % de prélèvements nasopharyngés positifs suffirait à estimer une sensibilité d'environ 0,75 avec une précision de 0,15 pour l'intervalle de confiance à 95 % et une puissance de 0,8.

Les caractéristiques démographiques et cliniques des participants éligibles seront résumées en utilisant la proportion moyenne et standard, ou les fréquences absolues et relatives, pour les variables continues et discrètes, respectivement. À des fins descriptives uniquement, les mêmes analyses statistiques seront également rapportées chez les sujets d'écouvillonnage nasopharyngé positifs et négatifs. En cas d'échec technique des tests sans possibilité de répéter la procédure, les participants seront exclus des analyses ultérieures. Chez les autres sujets, la sensibilité et la spécificité du CLDC (test index) par rapport à l'écouvillon nasopharyngé (test de référence 1) ou au FBC (test de référence 2) seront estimées, et leur intervalle de confiance à 95 % sera calculé à partir du distribution binomiale exacte. Ces analyses seront également répliquées selon les principales caractéristiques des sujets. Les participants seront caractérisés comme vrais positifs (TP), faux positifs (FP), ainsi que faux négatifs (FN) et vrais négatifs (TN), en termes de prévalence de résultats positifs CLDC-PCR, CLDC-FBC. L'association nulle sans différence entre TP, FP, FN et TN sera testée à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis.