Conteo diferencial de leucocitos y diagnóstico de Covid-19

Introducción. El 3 de junio de 2020, el gobierno italiano inició la llamada "Fase 2", que incluía la reapertura de las actividades laborales y sociales. En este marco, se ha planteado a nivel mundial la cuestión de cómo identificar a los individuos asintomáticos que, sin saberlo, pueden propagar la infección por SARS-CoV-2 y representar una amenaza para la salud pública. La población mundial ahora está experimentando la fase 3 de la pandemia con un rápido aumento en la propagación de la infección y en la aparición de nuevos casos. Ahora es imperativo garantizar la salud y la seguridad de las personas llamadas a trabajar y crear un protocolo de seguridad en los espacios comerciales y de reunión, lo que significa evitar que las personas infectadas provoquen nuevos brotes epidémicos. Para ello, se requiere un programa de tamizaje masivo bien establecido que satisfaga varias necesidades: primero, debe proporcionar el resultado en pocos minutos, debe ser entregado fácilmente en el territorio, los profesionales de la salud no médicos deben realizarlo de manera simple manera también, y debe ser no invasivo, repetible y confiable.

Hasta la fecha, el diagnóstico de infección por SARS-CoV-2 se realiza identificando el ARN viral en muestras recolectadas a través de un hisopado nasofaríngeo u otras muestras respiratorias. Esta técnica, sin embargo, tiene varias limitaciones para su aplicación en un cribado masivo, entre las que las más importantes son el tiempo necesario para el diagnóstico, la aglomeración de los centros destinados a analizar los ejemplares y el no despreciable riesgo de transmisión viral. a los trabajadores de la salud.

Las pruebas en el punto de atención con tiempos de respuesta rápidos permitirían una clasificación más efectiva en entornos donde las decisiones de control de infecciones y manejo de pacientes deben tomarse rápidamente.

Recientemente, se ha desarrollado un nuevo método para absolver la aparición de una infección grave por Sar-COV-2 y el COVID-19 resultante, detectando el aumento temprano en los niveles de leucocitos que tiene un conjunto característico de proporciones de tipos de leucocitos, que identifican el patógeno viral. y distinguirlo de muchos otros. Esta prueba permite la predicción de positivos a partir de resultados de hemograma completo, sensible hasta 14 días antes que la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), a un costo al menos un orden de magnitud menor que otras pruebas como RT-qPCR y anticuerpos. pruebas

Objetivo del estudio. El objetivo principal del estudio de precisión diagnóstica es validar el uso del dispositivo y algoritmo de recuento diferencial de leucocitos (CLDC) característico en el punto de atención para detectar la infección por SARS-CoV-2 en individuos sintomáticos y asintomáticos como un enfoque preliminar para una masa programa de cribado. La comparación está representada por las pruebas moleculares con hisopo nasofaríngeo, el estándar de oro del diagnóstico de COVID-19, para la validación de algoritmos y los análisis citométricos hematológicos de Coulter HMX, Beckman Coulter, para la validación de dispositivos.

Los objetivos secundarios son definir si los métodos CLCD pueden detectar la infección por SARS-CoV-2 antes en comparación con las pruebas moleculares con hisopo y realizar un estudio de rastreo de contactos en todos los pacientes con doble positivo para estimar su fecha original de infección para determinar la curva de prueba de sensibilidad contra la infección inicial.

Métodos. Los sujetos que se sometan al procedimiento de hisopado nasofaríngeo para el diagnóstico de infección por SARS-CoV-2 serán reclutados consecutivamente en el Laboratorio Clínico de IRCCS Neuromed en Pozzilli y Diagnostica Medica Spa en Avellino, Italia. Se evaluarán sujetos con bajo y alto riesgo de infección por Sar-Cov-2: trabajadores de la salud, pacientes que serán hospitalizados electivamente por un motivo distinto al COVID-19 u otra enfermedad infecciosa, personas que tuvieron contacto directo con pacientes infectados.

Al mismo tiempo que se realiza el procedimiento de hisopado nasofaríngeo por la mañana, cada sujeto reclutado también se evaluará utilizando el dispositivo y el algoritmo CLDC (CLCD 2). De forma voluntaria, los sujetos también se someterán a extracción de sangre (3 ml) para análisis citométricos hematológicos por Coulter HMX, Beckman Coulter y se evaluarán utilizando solo el algoritmo CLDC (CLCD 1).

Los evaluadores de resultados están cegados, ya que los resultados del análisis de rRT-PCR requieren al menos 6 horas antes de estar disponibles. El personal de investigación administrará un cuestionario sobre los síntomas y factores de riesgo de COVID-19 y para el seguimiento de contactos (día, modo) Los sujetos que den positivo en cualquiera de las pruebas CLDC pero negativo en el hisopo se someterán de forma voluntaria a nuevas pruebas de hisopo después de dos, 5 y posiblemente 8 días si sigue siendo negativo.

Los médicos independientes cegados a través de la transcripción inversa en tiempo real (rRT)-PCR analizarán el hisopo nasofaríngeo de acuerdo con las pautas internacionales.

Para la validación del dispositivo, se analizará el conteo sanguíneo completo (FBC) midiendo el conteo sanguíneo completo e ingresando los resultados en el portal Medichain CLDC-1 para un análisis rápido y a través del dispositivo de punto de atención conectado al teléfono inteligente (el Microscopio para teléfonos inteligentes Medichain CLDC-2: la prueba de Adstock).

El microscopio para teléfonos inteligentes Medichain CLDC-2, un dispositivo que se engancha a un teléfono inteligente estándar, se utilizará para analizar gotas de sangre de aproximadamente 1 µl untadas en un portaobjetos de microscopio (versión 2 - Prueba de Adstock) iluminado en modo de contraste de fase. Luego, las imágenes se enviarán desde los dispositivos a Medichain para su análisis en servidores en el Reino Unido y la verificación cruzada manual.

Luego, un algoritmo preparatorio Athena S3ER capaz de medir parámetros FBC específicos de entrada analiza los datos de este resultado y devuelve una salida; teniendo en cuenta la ocurrencia anormal en el número de parámetros FBC específicos al inicio de la infección. El portal de prueba básico para este estudio (conocido como el algoritmo S3ER) estaría en http://cldc.medichain.online. El portal extendido preferido es el portal de investigación en http://cldc.medichain.online/research Análisis de hisopado nasofaríngeo. Las muestras se someterán a inactivación térmica viral durante 1 minuto a 90 °C. La extracción de ARN del hisopo nasofaríngeo se realizará con el sistema de preparación de muestras mSample de Abbott (corporación Promega) y un sistema de extracción automatizado (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). El ARN extraído se amplificará con el kit GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp PCR (ELITechGroup), un sistema de rRT-PCR de un solo paso dirigido a los genes RdRp, E y N del SARS-CoV-2. Todos los sujetos reclutados se someterán al hisopado nasofaríngeo, por lo que no habrá sesgo de verificación parcial. La prueba CLDC y los procedimientos de hisopado nasofaríngeo se realizarán en el mismo momento para evitar el sesgo de progresión de la enfermedad. Dado que la prueba CLCD y el hisopo nasofaríngeo son analizados por médicos independientes cegados, se evitará el sesgo de información al interpretar los resultados de la tasa-PCR de los hisopos. La prueba de índice es completamente independiente de la prueba de referencia, para evitar el sesgo de incorporación. Los resultados no concluyentes serán registrados.

Tamaño de la muestra y análisis estadístico. La incidencia de positividad para COVID-19 se estima actualmente en 15% en la población general y 20% en personas de alto riesgo. Por tanto, estima encontrar entre 150 y 200 positivos en una población de 1000 sujetos con diferente riesgo de infección.

Un tamaño de muestra de 1000 con una prevalencia del 15% de hisopados nasofaríngeos positivos sería suficiente para estimar una sensibilidad en torno a 0,75 con una precisión de 0,15 para el intervalo de confianza del 95% y una potencia de 0,8.

Las características demográficas y clínicas de los participantes elegibles se resumirán mediante el uso de proporciones medias y estándar, o frecuencias absolutas y relativas, para variables continuas y discretas, respectivamente. Solo con fines descriptivos, los mismos análisis estadísticos se informarán también en sujetos con hisopado nasofaríngeo positivo y negativo. En caso de falla técnica de las pruebas sin posibilidad de repetir el procedimiento, los participantes serán excluidos de análisis posteriores. En los demás sujetos, se estimará la sensibilidad y especificidad del CLDC (test índice) al compararlo con el hisopado nasofaríngeo (test de referencia 1) o con el FBC (test de referencia 2), y se calculará su intervalo de confianza del 95% a partir de la distribución binomial exacta. Estos análisis también se replicarán según las principales características de los sujetos. Los participantes se caracterizarán como verdaderos positivos (TP), falsos positivos (FP), así como falsos negativos (FN) y verdaderos negativos (TN), en términos de prevalencia de resultados positivos CLDC-PCR, CLDC-FBC. La asociación nula de ninguna diferencia entre TP, FP, FN y TN se probará mediante una prueba de Kruskal-Wallis.