Дифференциальный подсчет лейкоцитов и диагностика Covid-19

Введение. 3 июня 2020 года итальянское правительство приступило к так называемому «Фазу 2», который включал в себя возобновление работы и общественной деятельности. В связи с этим во всем мире поднимается вопрос о том, как идентифицировать бессимптомных лиц, которые невольно могут распространять инфекцию SARS-CoV-2 и представлять угрозу для здоровья населения. Мировое население сейчас переживает 3-ю фазу пандемии с быстрым ростом распространения инфекции и возникновением новых случаев. В настоящее время крайне важно гарантировать здоровье и безопасность людей, вызванных обратно на работу, и создать протокол безопасности в коммерческих и конференц-залах, что означает предотвращение возникновения новых эпидемических вспышек зараженными людьми. Для этого необходима хорошо налаженная программа массового обследования, отвечающая нескольким требованиям: во-первых, она должна давать результат в течение нескольких минут, легко доставляться на территорию, немедицинские работники здравоохранения должны выполнять ее в простой способ также и должен быть неинвазивным, воспроизводимым и надежным.

На сегодняшний день диагноз инфекции SARS-CoV-2 ставится путем выявления вирусной РНК в образцах, взятых с помощью мазка из носоглотки или других образцов из дыхательных путей. Этот метод, однако, имеет несколько ограничений для его применения в массовом скрининге, среди которых наиболее важными являются время, необходимое для диагностики, скученность тех центров, которые назначены для анализа образцов, и значительный риск передачи вируса. работникам здравоохранения.

Тестирование в месте оказания медицинской помощи с коротким временем выполнения позволит более эффективно проводить сортировку в условиях, когда необходимо быстро принимать решения о ведении пациентов и инфекционном контроле.

Недавно был разработан новый метод подтверждения возникновения тяжелой инфекции Sar-COV-2 и вызванной ею COVID-19, выявляющий ранний подъем уровня лейкоцитов, имеющий характерный набор соотношений типов лейкоцитов, по которым идентифицируют вирусный возбудитель. и выделить его из ряда других. Этот тест позволяет прогнозировать положительные результаты по результатам полного анализа крови, чувствителен до 14 дней раньше, чем количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR), при стоимости как минимум на порядок ниже, чем другие тесты, такие как RT-qPCR и антитела. тесты.

Цель исследования. Основная цель исследования диагностической точности — подтвердить использование устройства и алгоритма дифференциального подсчета лейкоцитов (CLDC) по месту оказания медицинской помощи для выявления инфекции SARS-CoV-2 как у лиц с симптомами, так и у бессимптомных лиц в качестве предварительного подхода к массовым исследованиям. программа скрининга. Сравнение представлено молекулярным тестированием мазка из носоглотки, золотым стандартом диагностики COVID-19, для проверки алгоритма и гематологического цитометрического анализа Coulter HMX, Beckman Coulter, для проверки устройства.

Вторичные цели заключаются в том, чтобы определить, способны ли методы CLCD выявлять инфекцию SARS-CoV-2 раньше, чем при молекулярном тестировании мазка, и провести исследование по отслеживанию контактов всех пациентов с двойным положительным результатом, чтобы оценить их первоначальную дату заражения, чтобы определить кривую тест на чувствительность к начальной инфекции.

Методы. Субъекты, которые проходят процедуру мазка из носоглотки для диагностики инфекции SARS-CoV-2, будут последовательно набираться в клиническую лабораторию IRCCS Neuromed в Поццелли и Diagnostica Medica Spa в Авеллино, Италия. Будут протестированы субъекты с низким и высоким риском заражения Sar-Cov-2: медицинские работники, пациенты, подлежащие плановой госпитализации по причине, отличной от COVID-19 или другого инфекционного заболевания, лица, имевшие непосредственный контакт с инфицированными пациентами.

Одновременно с процедурой утреннего мазка из носоглотки каждый привлеченный субъект также будет протестирован с использованием устройства и алгоритма CLDC (CLCD 2). На добровольной основе субъекты также будут брать кровь (3 мл) для гематологического цитометрического анализа с помощью Coulter HMX, Beckman Coulter и будут протестированы с использованием только алгоритма CLDC (CLCD 1).

Оценщики исходов ослеплены, поскольку для получения результатов анализа rRT-PCR требуется не менее 6 часов. Исследовательский персонал заполнит анкету о симптомах и факторах риска COVID-19, а также для отслеживания контактов (день, режим) Субъекты, дающие положительный результат теста CLDC, но отрицательный результат мазка, на добровольной основе пройдут новый анализ мазка через два, 5 и, возможно, 8 дней, если все еще отрицательно.

Независимые слепые клиницисты с помощью обратной транскрипции (rRT)-PCR в реальном времени проанализируют мазок из носоглотки в соответствии с международными рекомендациями.

Для проверки устройства полный анализ крови (FBC) будет проанализирован как путем измерения полного анализа крови, так и ввода результатов на портал Medichain CLDC-1 для быстрого анализа, а также с помощью устройства для оказания медицинской помощи, подключенного к смартфону ( Смартфонный микроскоп Medichain CLDC-2 — тест Adstock).

Смартфонный микроскоп Medichain CLDC-2, устройство, которое крепится к стандартному смартфону, будет использоваться для анализа капель крови объемом примерно 1 мкл, размазанных на предметном стекле микроскопа (версия 2 — Adstock Test), освещенных в фазово-контрастном режиме. Затем изображения будут отправлены с устройств в Medichain для анализа на серверах в Великобритании и ручной перекрестной проверки.

Затем подготовительный алгоритм Athena S3ER, способный измерять определенные входные параметры FBC, анализирует данные из этого результата и возвращает выходные данные; с учетом аномального появления ряда специфических параметров ОАК в дебюте инфекции. Базовый тестовый портал для этого исследования (известный как алгоритм S3ER) будет находиться по адресу http://cldc.medichain.online. Предпочтительным расширенным порталом является исследовательский портал по адресу http://cldc.medichain.online/research. Анализ мазка из носоглотки. Образцы будут подвергаться термической инактивации вирусов в течение 1 минуты при 90 °C. Выделение РНК из мазка из носоглотки будет выполняться с помощью системы подготовки образцов Abbott mSample (корпорация Promega) и автоматизированной системы выделения (Extraction m2000SP, Abbott Molecular). Извлеченная РНК будет амплифицирована с помощью набора для ПЦР GeneFinderTM COVID19 Plus RealAmp (ELITechGroup), одноэтапной системы rRT-PCR, нацеленной на гены SARS-CoV-2 RdRp, E и N. У всех набранных субъектов будет взят мазок из носоглотки, таким образом, систематическая ошибка частичной проверки будет отсутствовать. Тест CLDC и процедуры мазка из носоглотки будут выполняться одновременно, чтобы избежать систематической ошибки прогрессирования заболевания. Поскольку тест CLCD и мазок из носоглотки анализируются независимыми ослепленными клиницистами, при интерпретации результатов скорости ПЦР мазков можно избежать предвзятости информации. Тест индекса полностью независим от эталонного теста, чтобы избежать систематической ошибки включения. Неубедительные результаты будут записаны.

Размер выборки и статистический анализ. Частота положительных результатов на COVID-19 в настоящее время оценивается в 15% среди населения в целом и 20% среди людей с высоким риском. Таким образом, по оценкам, можно найти от 150 до 200 положительных результатов в популяции из 1000 субъектов с разным риском заражения.

Размер выборки 1000 с преобладанием 15% положительных мазков из носоглотки будет достаточным для оценки чувствительности около 0,75 с точностью 0,15 для 95% доверительного интервала и мощностью 0,8.

Демографические и клинические характеристики подходящих участников будут обобщены с использованием среднего и стандартного соотношения или абсолютной и относительной частоты для непрерывных и дискретных переменных соответственно. Исключительно для описательных целей, такие же статистические анализы будут представлены также для положительных и отрицательных субъектов мазка из носоглотки. В случае технического сбоя тестирования без возможности повторения процедуры участники будут исключены из дальнейших анализов. У других субъектов будут оцениваться чувствительность и специфичность для CLDC (индексный тест) по сравнению с мазком из носоглотки (эталонный тест 1) или с FBC (референтный тест 2), и их 95% доверительный интервал будет рассчитываться на основе точное биномиальное распределение. Эти анализы также будут воспроизведены в соответствии с основными характеристиками субъекта. Участники будут охарактеризованы как истинно положительные (TP), ложноположительные (FP), а также ложноотрицательные (FN) и истинно отрицательные (TN) с точки зрения распространенности положительных результатов CLDC-PCR, CLDC-FBC. Нулевая ассоциация отсутствия различий между TP, FP, FN и TN будет проверена с использованием теста Крускала-Уоллиса.